小反芻獸疫血清抗體免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)檢測方法的建立.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Pest des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性、高度接觸性烈性傳染病，主要感染山羊和綿羊等小反芻動(dòng)物。PPR自1942年在非洲被發(fā)現(xiàn)以來，不斷向全球蔓延。2007年7月，我國首次在西藏爆發(fā)PPR疫情，2013年至2014年全國19個(gè)省區(qū)再次爆發(fā)PPR疫情，對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損

2、失。2015年4月，在科特迪瓦首都阿比讓舉行的動(dòng)物衛(wèi)生專家會(huì)議一致同意，嘗試在全球消除小反芻獸疫病毒。因此，盡快開展小反芻獸疫的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷與預(yù)防控制技術(shù)的綜合性研究，建立快速敏感的診斷方法對(duì)PPR的防控具有深遠(yuǎn)的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。
　　目前針對(duì)PPRV的診斷方法較多，其中血清學(xué)檢測方法主要是病毒中和試驗(yàn)(virusneutralization test，VNT)和競爭ELISA方法，但前者存在操作周期長，因操作活病毒而設(shè)

3、施要求高等缺點(diǎn);后者存在價(jià)格較貴、制備復(fù)雜等缺點(diǎn)。免疫過氧化酶單層試驗(yàn)(immunoperoxidasemonolayer assay，IPMA)具有快速、敏感、特異、操作簡單的特點(diǎn)，已應(yīng)用于多種病原的血清臨床樣本檢測。但國內(nèi)外還沒有建立針對(duì)PPRV的IPMA檢測方法，因此建立PPRV-IPMA檢測方法對(duì)于PPR疫情的監(jiān)測和防控具有一定的重要意義。
　　為建立針對(duì)PPR的IPMA檢測方法，本研究首先建立了穩(wěn)定表達(dá)山羊SLAM的BH

4、K-21細(xì)胞系(BHK-gSLAM)。rPPRV/GFP感染該細(xì)胞系后，能復(fù)制增殖且形成明顯的合胞體，而在親本細(xì)胞上無該現(xiàn)象。Westem blot試驗(yàn)表明該細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)SLAM蛋白至少20代。在細(xì)胞系建立的基礎(chǔ)上，通過感染rPPRV/GFP制備抗原檢測板，建立了IPMA檢測方法，具體步驟如下:首先比較了Vero細(xì)胞和BHK-gSLAM兩者在IPMA試驗(yàn)中的差別，結(jié)果表明，在IPMA反應(yīng)板制備過程中，同等劑量的rPPRV/GFP感染

5、Vero和BHK-gSLAM細(xì)胞，后者病變形成時(shí)間更早，并形成易于觀察的合胞體;BHK-gSLAM細(xì)胞生長更緊密，形成的CPE更明顯，其在AEC染色后更易于觀察，因此最終選擇該細(xì)胞系用于IPMA抗原檢測板的制備。其次，本研究優(yōu)化并確定了IPMA的最佳接毒劑量為104 TCID50/mL，病毒感染72 h后固定制備IPMA反應(yīng)板，血清最佳起始稀釋度為1∶10，二抗最佳工作濃度為1∶5000。最后，用該IPMA檢測方法對(duì)198份羊血清（包括