犬冠狀病毒及其受體單克隆抗體的研制與免疫過(guò)氧化物酶噬斑染色檢測(cè)方法的建立.pdf

1、　　犬冠狀病毒(CCV)冠狀病毒科，冠狀病毒屬Ⅰ群冠狀病毒，有4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突(S)蛋白，膜(M)蛋白，核(N)蛋白及小膜(SM)蛋白。本研究應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)，分別制備了抗CCV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及抗CCV細(xì)胞受體的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)CCV一些特性及病毒與細(xì)胞受體相互關(guān)系進(jìn)行探討，并建立了免疫過(guò)氧化物酶噬斑染色方法用于CCV感染的血清學(xué)診斷。以純化的犬冠狀病毒(CCV)1-71株免疫BALB/C小鼠，取脾細(xì)胞和SP

2、2/0細(xì)胞融合，用間接ELISA和中和試驗(yàn)(NT)篩選陽(yáng)性克隆并用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。用A72細(xì)胞包被檢測(cè)，剔除與細(xì)胞蛋白交叉反應(yīng)陽(yáng)性的克隆，得到5株雜交瘤細(xì)胞株，其中2株是只有ELISA值的單克隆抗體細(xì)胞株(E8和H6)，3株既有ELISA值，又有中和性單克隆抗體細(xì)胞株(N9、A4和D5)。免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果顯示：E8、H6識(shí)別蛋白大小為45kD，100kD及200kD左右。N9，A4和D5識(shí)別的蛋白條帶分別在45kD，60kD和100k

3、D及200kD左右，間接免疫熒光試驗(yàn)出現(xiàn)綠色熒光。　　建立免疫過(guò)氧化物酶噬斑(IP)染色技術(shù)，用于犬冠狀病毒感染診斷。通過(guò)中和試驗(yàn)(NT)與間接ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性和陰性血清系列稀釋加入IP檢測(cè)系統(tǒng)，確定IP檢測(cè)CCV血清抗體陰陽(yáng)性臨界值為血清40倍稀釋，即IP≥40為抗體陽(yáng)性，IP＜40為抗體陰性。并利用建立的IP試驗(yàn)對(duì)63份犬血清進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示IP和NT檢測(cè)健康犬血清20份結(jié)果一致，而腹瀉犬的43份犬血清中，33份NT抗體陰

4、性，10份陽(yáng)性，28份IP試驗(yàn)抗體陰性，15份陽(yáng)性，二者不相符者為5份(15.2﹪)。顯示，IP檢測(cè)CCV抗體較NT試驗(yàn)敏感?！　∪跔畈《就ㄟ^(guò)和細(xì)胞受體結(jié)合而感染細(xì)胞。用犬纖維瘤細(xì)胞(A72)免疫Balb/c小鼠，通過(guò)阻斷CCV感染細(xì)胞試驗(yàn)得到一株單抗R-H-2，免疫轉(zhuǎn)印顯示，在分子量為150kD左右有一條明顯條帶。阻斷病毒感染的噬斑染色方法顯示CCV1-71和TN449感染A72細(xì)胞噬斑數(shù)明顯減少，抑制率分別為98.8﹪和95.6