農(nóng)桿菌介導(dǎo)小反芻獸疫病毒H、F基因轉(zhuǎn)化苜蓿的初步研究.pdf

1、本文利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將小反芻獸疫病毒H基因轉(zhuǎn)入苜蓿中，為制備防治小反芻獸疫的轉(zhuǎn)基因牧草疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 小反芻獸疫病毒(PPRV)植物表達(dá)載體的構(gòu)建是采用TA克隆的方法，從PPRV質(zhì)粒中分別擴(kuò)增出H，F(xiàn)基因，在H基因終止密碼子前加入KDEL序列，形成H-KDEL，煙草SRI中擴(kuò)增出促進(jìn)外源基因表達(dá)的MAR12序列和MAR34序列，pHL005質(zhì)粒中擴(kuò)增出報(bào)告基因-綠色熒光蛋白GFP基因，以上克隆均帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)，結(jié)果顯示

2、所克隆的基因和序列均與理論大小相符，說明各種克隆載體構(gòu)建成功。將GFP基因插入到表達(dá)載體pBI121替代GUS基因，便于植物活體組織檢測;將PPRV-H、PPRV-H-KDEL基因插入到pBI121-GFP，構(gòu)建植物表達(dá)栽體pBI121-GFP-H和pBI121-GFP-H-KDEL;將MAR序列插入到pBI121-GFP基因的一側(cè)，構(gòu)成中間載體MAR-pBI121-GFP，再將PPRV-H、PPRV-H-KDEL、PPRV-F插入MA

3、R-pBI121-GFP，從而構(gòu)成植物表達(dá)載體MAR-pBI121-GFP-H、MAR-pBI121-GFP-H-KDEL和MAR-pBI121-GFP-F。經(jīng)酶切、PCR檢測上述植物表達(dá)載體都構(gòu)建正確。
　　 成功構(gòu)建表達(dá)載體后，用苜蓿品種甘農(nóng)1號下胚軸為外植體，通過凍融法將植物表達(dá)載體pBI121-GFP-H轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。并且進(jìn)一步采用葉片預(yù)培養(yǎng)3d，用農(nóng)桿菌菌液侵染15min，在培養(yǎng)基上鋪一層滅菌濾紙共培養(yǎng)3d