茅莓總皂苷對腦缺血保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、本文對茅莓RubusparvifloliusL．的有效部位茅莓總皂苷所具有的腦缺血保護(hù)作用開展了系統(tǒng)的實驗研究。研究內(nèi)容包括：通過藥理篩選確定茅莓抗腦缺血的有效部位；以色譜法分離純化茅莓總皂苷中用于定性和定量研究的對照品；以大孔吸附樹脂對茅莓總皂苷進(jìn)行精制；用局灶性腦缺血再灌注動物模型和神經(jīng)元氧糖剝奪細(xì)胞模型，從整體、細(xì)胞及分子水平觀察茅莓總皂苷保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)制；采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的策略，觀察茅莓總皂苷對局灶性腦缺血再灌注

2、動物模型蛋白表達(dá)的影響。全文分為三部分。 第一部分茅莓抗腦缺血有效部位的藥理篩選、制備、對照品的分離鑒定 第一節(jié)茅莓抗腦缺血有效部位的初步篩選 目的：篩選茅莓提取物抗腦缺血的有效部位。方法：使用不同極性的溶劑分別提取茅莓得到不同的部位，采用不同的動物模型，分別觀察茅莓各提取物對斷尾小鼠出血時間的影響，對肝素化小鼠出血時間和出血量的影響；對小鼠常壓耐缺氧生存時間的影響；對斷頭小鼠喘氣時間的影響；對結(jié)扎小鼠雙側(cè)總動脈

3、6h存活率的影響。結(jié)果：小鼠灌胃給予茅莓各提取物3d后，正丁醇萃取物能非常顯著的延長斷尾小鼠出血時間；對肝素化小鼠出血量明顯增加；延長小鼠常壓缺氧生存時間；延長斷頭小鼠喘氣時間；降低結(jié)扎雙側(cè)總動脈小鼠死亡率。結(jié)論：正丁醇萃取物對腦缺血缺氧有明顯的保護(hù)作用。經(jīng)過化學(xué)成分確認(rèn)，正丁醇萃取物一茅莓總皂苷是茅莓抗腦缺血的有效部位。 第二節(jié)茅莓總皂苷中對照品的提取、分離、鑒定 目的：從茅莓Rubusparvifioliu

4、sL中提取、分離單體化合物作為質(zhì)量研究的對照品。方法：采用柱色譜和制備型高效液相色譜進(jìn)行分離純化得到目標(biāo)化合物，通過理化方法和光譜分析鑒定該化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果與結(jié)論：該化合物經(jīng)鑒定為suavissimosideR1． 第三節(jié)茅莓總皂苷的提取、分離工藝研究 目的：研究D101大孔吸附樹脂富集、純化茅莓總皂苷的工藝條件及參數(shù)。方法：以茅莓總皂苷的洗脫率和純度為考察指標(biāo)，研究大孔吸附樹脂富集、純化茅莓總皂苷的吸附性能和洗脫

5、參數(shù)。結(jié)果：茅莓提取液上大孔吸附樹脂柱，依次用不同濃度乙醇依次洗脫，茅莓總皂苷富集于40％乙醇洗脫液部分。結(jié)論：通過大孔吸附樹脂富集、純化后，茅莓總皂苷的洗脫率在754％以上，總固物中茅莓總皂苷含量可達(dá)64．42％。 第二部分茅莓總皂苷對腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制的tiJt：究 第一節(jié)茅莓總皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用 目的：探討茅莓總皂苷(TSRP)對局灶性腦缺血的保護(hù)作用。 方法

6、：采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，實驗分為六組：假手術(shù)組，模型組，TSRP5、10、20mg．kg-1和NimlOmg．kg-1組。假手術(shù)組，模型組給予等量生理鹽水，各治療組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，每天給藥1次，連續(xù)3d。分別觀察(1)腦缺血2h再灌注6、24、48、72h的動物模型，測定各組在相應(yīng)時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失體征、病理學(xué)改變(普通光鏡和電鏡)、腦含水量(BWC)的變化、腦內(nèi)伊文思藍(lán)(EB)含量的變化；(2)腦缺血2

7、h再灌注24h的動物模型，采用TTC染色法分別測定各實驗組腦梗死區(qū)體積；采用測試藥盒測定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性。(3)原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀測腦缺血2h再灌注24h各實驗組大鼠腦缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目的差異。結(jié)果： LTSRP各劑量組神經(jīng)功能缺失體征評分減少，與CIR相比均有顯著性差異。 2．TSRP各劑量組腦缺血2h再灌注24h腦梗死體積明顯縮

8、小，與CIR相比均有顯著性差異。 3．TSRP各劑量組光鏡和電鏡觀察各時點(diǎn)病理改變明顯減輕。 4．TSRP各劑量組腦含水量、EB含量不同程度下降，各時間點(diǎn)與CIR相比有顯著性差異。 5．TSRP各劑量組SOD、GSH-Px活性明顯高于CIR組，MDA含量明顯低于CIR組。 6．TSRP各劑量組缺血周邊區(qū)凋亡細(xì)胞明顯減少。 結(jié)論：TSRP對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織有保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與抗自

9、由基、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。 第二節(jié)茅莓總皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡柘關(guān)基因表達(dá)的影響 目的：觀察茅莓總皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響。方法：采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血2h再灌注6、24、48、72h模型，實驗分為六組：假手術(shù)組，模型組，TSRP5、10、20mg．kg-1組和NimlOmg．kg-1組。假手術(shù)組，模型組給予等量生理鹽水，各治療組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物

10、，每天給藥1次，連續(xù)3d。應(yīng)用原位雜交檢測各實驗組Bcl-2mRNA，BaxmRNA的表達(dá)；應(yīng)用免疫組化檢測各實驗組Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)；應(yīng)用Westernblotting法檢測各實驗組Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)原位雜交檢測CIR后腦組織Bcl-2mRNA，BaxmRNA的表達(dá)，隨再灌注時間的延長，表達(dá)增加，TSRP各劑量組各時間點(diǎn)Bcl-2mRNA表達(dá)均不同程度增強(qiáng)，BaxmRNA表達(dá)均不同程度降低。與CIR組

11、相比有顯著性差異。(2)免疫組化檢測CIR后腦組織Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)，隨再灌注時間的延長，表達(dá)增加，TSRP各劑量組各時間點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)均不同程度增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)均不同程度降低。與CIR組相比有顯著性差異。(3)Westernblotting法檢測CIR后腦組織Bcl-2，Bax蛋白的表達(dá)，隨再灌注時間的延長，表達(dá)增加，TSRP20mg．kg-1組各時間點(diǎn)Bcl-2蛋白表達(dá)均不同程度增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)均不同程度降低

12、。與CIR組相比有顯著性差異；結(jié)論：TSRP抗凋亡機(jī)制可能與增加Bcl-2陽性表達(dá)，降低Bax陽性表達(dá)有關(guān)。 第三節(jié)茅莓總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織興奮性氨基酸(EAA)含量的影響 目的：研究茅莓總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織興奮性氨基酸(EAA)含量的影響。方法：將大鼠隨機(jī)分為茅莓總皂苷5、10、20mg．kg-1組13．Nimlomg．kg。組、模型組和假手術(shù)組。灌胃給藥3d，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈

13、缺血再灌注模型，相應(yīng)時間斷頭取腦。采用高效液相法測定大鼠腦組織中Asp、Glu的含量。結(jié)果：缺血對照組Asp、Glu含量明顯高于治療組。結(jié)論：茅莓總皂苷對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。其可能的機(jī)制為：干擾腦缺血再灌注損傷中EAA代謝而發(fā)揮腦保護(hù)作用。 第四節(jié)茅莓總皂苷對缺氧損傷后神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)【ca21i的影響 目的：研究茅莓總皂苷對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元缺血損傷鈣離子的動態(tài)變化。方法：大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)后，用Fluo-2／

14、AM負(fù)載培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，氧糖剝奪30min，在激光共聚焦顯微鏡下監(jiān)測茅莓總皂苷對海馬神經(jīng)元的[Ca2+]i的變化。結(jié)果：茅莓總皂苷10-Sg．L～，10-4g．L～，10一。g．L-1和Niml0-Sm01．L-1組能不同程度降低缺氧缺糖30min后大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。結(jié)論：茅莓總皂苷可通過減輕細(xì)胞內(nèi)的鈣超載來對缺血神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)。 第三部分茅莓總皂苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：采