神經(jīng)肽CRH作為急性高原低氧應(yīng)激損傷的生物標(biāo)志分子研究.pdf

1、我國西部的青藏高原，最突出的自然環(huán)境特征就是低氧，隨著西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施，日益增多的援建移民、旅游、探險(xiǎn)、軍事?lián)Q防等，使得每年有數(shù)百萬人進(jìn)入青藏高原，面臨高原低氧損傷的危險(xiǎn)。急性高原反應(yīng)和急性高原病(AMS)是人體快速暴露于高原低氧環(huán)境后產(chǎn)生的各種生理反應(yīng)和低氧性疾病，常見的癥狀有頭痛，惡心嘔吐，全身乏力，頭暈和睡眠障礙等。急性高原病是人類到達(dá)高原的主要挑戰(zhàn)，AMS的發(fā)病率隨著所到達(dá)的高度升高而顯著升高，在1850米到2750米時(shí)有2

2、5％的發(fā)病率，在3000米時(shí)有42％的發(fā)病率，而在6000米的時(shí)候發(fā)病率高達(dá)75％。如果AMS得不到及時(shí)正確的治療，可能會(huì)發(fā)展成為嚴(yán)重的危及生命的高原肺水腫(HAPE)和腦水腫(HACE)。AMS極大地限制了人們?cè)诟咴幕顒?dòng)。研究AMS的發(fā)病機(jī)制，預(yù)警預(yù)測(cè)AMS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義，然而目前AMS的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，人們?cè)噲D研究探索快速有效地預(yù)測(cè)AMS，提出低氧通氣反應(yīng)，心率變異率，最大運(yùn)動(dòng)后的氧飽和度的變化等指標(biāo)來預(yù)測(cè)AM

3、S的發(fā)生，但都不能有效地預(yù)測(cè)其發(fā)生。我們實(shí)驗(yàn)室以前的研究發(fā)現(xiàn)高原低氧促進(jìn)神經(jīng)肽促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)在下丘腦的分泌及其1型受體(CRHR1)的過度表達(dá)，在腦-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)低氧損傷調(diào)節(jié)過程中起核心主導(dǎo)的作用，所以我們提出CRH可能成為預(yù)測(cè)急性高原低氧應(yīng)激損傷的生物標(biāo)志分子，證明血漿和唾液CRH水平過度增高與發(fā)生AMS相關(guān)，通過檢測(cè)唾液CRH水平變化程度，可以預(yù)測(cè)人們到達(dá)高原后可能發(fā)生AMS的潛在風(fēng)險(xiǎn)性。
　　本研究分

4、為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究和人類研究兩部分。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，成年大鼠被置于低壓氧艙中分別模擬2，5，和7km不同海拔高度高原低氧8小時(shí)以及海拔7km高原低氧2，8和24小時(shí)不同時(shí)間，研究大鼠下丘腦和外周血液CRH和皮質(zhì)酮水平的相應(yīng)變化，分析下丘腦和血漿CRH線性相關(guān)性。還研究了大鼠腦CRHR1和CRHR2受體基因的表達(dá)變化模式，探討了CRHR1在低氧腦細(xì)胞損傷中的作用。在以人類為對(duì)象的研究中，令志愿者進(jìn)行自行車功量儀運(yùn)動(dòng)和登高跑運(yùn)動(dòng)兩種平原耗竭運(yùn)動(dòng)模

5、擬低氧，檢測(cè)運(yùn)動(dòng)前后血漿和唾液中CRH和皮質(zhì)醇水平，測(cè)定心率，氧飽和度，以及血清和唾液中的乳酸脫氫酶(LDH)水平;此外，志愿者進(jìn)入3600和5500海拔的青藏高原現(xiàn)場(chǎng)，結(jié)合Lake Louise Score AMS標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行AMS問卷調(diào)查，根據(jù)臨床AMS癥狀和發(fā)病率以及血漿、唾液CRH水平的相關(guān)變化，計(jì)算分析了CRH和發(fā)生AMS風(fēng)險(xiǎn)間的相關(guān)性。提出了應(yīng)用檢測(cè)唾液CRH水平預(yù)測(cè)發(fā)生高原AMS風(fēng)險(xiǎn)的方法。
　　結(jié)果
　　1.低

6、氧強(qiáng)度和時(shí)間依賴性地增加大鼠腦PVN區(qū)CRH的分泌低氧顯著性降低大鼠腦PVN和ME處CRH蛋白水平，升高大鼠垂體CRH水平，這個(gè)變化呈現(xiàn)低氧強(qiáng)度和時(shí)間變化依賴的關(guān)系。低氧顯著性增加大鼠腦PVN區(qū)CRH mRNA的表達(dá)，隨著低氧強(qiáng)度的增加，CRH mRNA的表達(dá)也增加。
　　2.低氧強(qiáng)度和時(shí)間依賴性地升高大鼠血漿CRH和皮質(zhì)酮水平及相關(guān)性分析低氧誘導(dǎo)大鼠血漿CRH水平升高，低氧后CRH水平的變化呈現(xiàn)低氧強(qiáng)度和時(shí)間依賴的關(guān)系。低氧誘導(dǎo)

7、大鼠血漿皮質(zhì)酮水平升高，皮質(zhì)酮水平的變化同樣呈現(xiàn)低氧強(qiáng)度和時(shí)間依賴的變化。
　　3.低氧升高大鼠血漿CRH與中樞CRH分泌增加的相關(guān)性分析低氧升高大鼠血漿CRH水平和低氧刺激PVN區(qū)CRH釋放相關(guān)，下丘腦CRH水平與血漿CRH水平呈負(fù)相關(guān)。血漿CRH水平與皮質(zhì)酮水平呈正相關(guān)。
　　4.低氧刺激大鼠不同腦區(qū)和垂體CRHR1和CRHR2受體的不同表達(dá)模式低氧后大鼠皮層、海馬、杏仁中央核、PVN和藍(lán)斑區(qū)CRHR1 mRNA表達(dá)升高

8、，在7km高原低氧8小時(shí)達(dá)到峰值，低氧24小時(shí)后開始回落。大鼠垂體CRHR1mRNA表達(dá)模式相同。大鼠皮層、海馬、杏仁中央核、藍(lán)斑區(qū)和垂體CRHR2 mRNA表達(dá)降低，而下丘腦PVN區(qū)CRHR2 mRNA的表達(dá)與CRHR1 mRNA的表達(dá)模式相似的升高。
　　CRHR1 mRNA和CRHR2 mRNA在不同腦區(qū)的相對(duì)表達(dá)水平不同，其中在皮層，杏仁核，藍(lán)斑CRHR1 mRNA的表達(dá)水平是CRHR2 mRNA的3-5倍，而海馬，PVN

9、和垂體中CRHR1和CRHR2 mRNA的表達(dá)水平相近。低氧后，CRHR1和CRHR2 mRNA表達(dá)水平差異顯著，7km海拔低氧8小時(shí)后最為明顯，其中在皮層，杏仁中央核和藍(lán)斑區(qū)兩型受體表達(dá)水平相差8倍，而海馬，PVN區(qū)和垂體兩型受體相差2倍。
　　5.低氧過度激活大鼠腦皮層CRHR1與皮層細(xì)胞凋亡相關(guān)大鼠皮層促凋亡基因(bim，bnip3，bax) mRNA表達(dá)水平在5km高原低氧8小時(shí)和7km高原低氧2和8小時(shí)后顯著升高，而抗凋

10、亡基因bcl-2 mRNA在2km高原低氧8小時(shí)后升高，5和7km高原低氧8小時(shí)后下降。凋亡蛋白caspase-3的活性在7km高原低氧8和24小時(shí)后都有顯著升高。HE和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，7km高原低氧8小時(shí)后，大鼠皮層細(xì)胞腫脹，間隙加大，凋亡細(xì)胞顯著增加。而預(yù)先使用CRHR1拮抗劑CP154，526處理后，能顯著降低低氧誘導(dǎo)的凋亡基因bim和bax的表達(dá)升高，下調(diào)凋亡蛋白caspase-3的活性，降低凋亡細(xì)胞數(shù)目。
　　6.急

11、性耗竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)人體低氧生理反應(yīng)志愿者登高跑運(yùn)動(dòng)后，心率由86±10/分鐘升高到177±16/分鐘，唾液LDH活性由199.7±112.7 U/L升高到468.7±279.9 U/L，而血清LDH活性沒有顯著變化，同時(shí)動(dòng)脈血氧飽和度從98％±1％降低到93％±3％。自行車功量儀運(yùn)動(dòng)后心率從82±11/min升高到166±18/min，唾液LDH活性從156.7±92.5 U/L升高到294±187.6 U/L，而血清LDH活性沒有明顯變化

12、，動(dòng)脈血氧飽和度同樣從98％±1％降低到94％±1％。
　　7.急性耗竭運(yùn)動(dòng)和高原低氧誘導(dǎo)人體唾液和血液CRH水平升高檢測(cè)健康人體唾液CRH和皮質(zhì)醇水平存在明顯的晝夜節(jié)律，唾液CRH水平在清晨7:00最高，中午11:00下降，在下午15:00和19:00保持一個(gè)穩(wěn)定的水平，夜間23:00時(shí)降低到最低水平，唾液皮質(zhì)醇的變化趨勢(shì)和唾液CRH相同。
　　耗竭運(yùn)動(dòng)低氧誘導(dǎo)唾液和血漿CRH和皮質(zhì)醇水平顯著升高，在登高跑運(yùn)動(dòng)后，唾液和血

13、漿CRH水平分別從25.25±6.41 pg/ml和39.82±7.87 pg/ml升高到35.78±8.51 pg/ml和54.37±9.31 pg/ml，唾液和血漿皮質(zhì)醇水平分別從1.62±0.54 ng/ml和6.5±1.51 ng/ml升高到3.52±1.22 ng/ml和10.8±2.58 ng/ml。自行車功量儀運(yùn)動(dòng)后，唾液CRH和皮質(zhì)醇水平分別從5.68±6.15 pg/ml和1.96±0.53 ng/ml升高到40.21

14、±10.1 pg/ml和4.11±1.12 ng/ml。
　　志愿者在快速到達(dá)青藏高原3.6和5.5km后，唾液和血漿CRH分別從17.97±4.46 pg/ml和43.71±9.1 pg/ml升高到53.04±16.06 pg/ml和106.7±31.7pg/ml，唾液和血漿皮質(zhì)醇分別從1.87±0.51ng/ml和11.43±2.76ng/ml升高到3.84±0.99ng/ml和1.72±5.81ng/ml。
　　急性耗

15、竭運(yùn)動(dòng)和高原低氧暴露前后，唾液和血漿CRH都有很好的線性相關(guān)性。在耗竭運(yùn)動(dòng)前后，唾液和血漿CRH水平的相關(guān)系數(shù)分別是0.9336和0.9086。而高原現(xiàn)場(chǎng)低氧暴露前后，唾液和血漿CRH水平的相關(guān)系數(shù)分別是0.8410和0.8142。此外，在急性耗竭運(yùn)動(dòng)后CRH水平和皮質(zhì)醇水平也有很好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)是0.9228和0.9437，而志愿者暴露于高原環(huán)境低氧后，CRH水平和皮質(zhì)醇水平無明顯相關(guān)性。
　　8.高原低氧AMS和血液、唾

16、液高CRH水平相關(guān)人類志愿者分別從平原快速到達(dá)海拔3.6 km和5.5 km高度的青藏高原，到達(dá)高原后，使用AMS評(píng)分量表(Lake Louise Score)測(cè)定了個(gè)體AMS癥狀(AMS癥狀:包括頭痛，惡心嘔吐，全身無力，頭昏和失眠)。在3.6 km組，AMS的發(fā)病率是28.6％（63人中有18人發(fā)?。?，其中50.7％的志愿者出現(xiàn)頭疼，6.2％出現(xiàn)惡心嘔吐，41.2％出現(xiàn)金身無力，49.2％出現(xiàn)頭昏，17.4％的志愿者出現(xiàn)失眠。而在5

17、.5km組，AMS發(fā)病率是50％（48人中有24人發(fā)?。渲蓄^痛，惡心嘔吐，全身無力，頭昏和失眠的發(fā)生率分別是50％，37.5％，41.7％，39.6％和21.7％。根據(jù)AMS評(píng)分量表將志愿者分為AMS發(fā)病組和AMS未發(fā)病組，其中AMS發(fā)病組的血漿和唾液CRH水平比AMS未發(fā)病組高40％，而血漿皮質(zhì)醇沒有顯著差異。
　　9.唾液CRH基礎(chǔ)水平可預(yù)測(cè)進(jìn)入高原后發(fā)生AMS的風(fēng)險(xiǎn)性無論3.6 km組中唾液和血漿基礎(chǔ)CRH，還是5.5k

18、m組的血漿基礎(chǔ)CRH都可以預(yù)測(cè)AMS的發(fā)生，ROC曲線下的面積(Area under curve，AUC)可以用來衡量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，3種樣本的AUC分別是0.7292，0.6和0.7236。從ROC曲線上我們也得出了最佳預(yù)測(cè)診斷閾值?；A(chǔ)血漿CRH水平大于或等于50.33 pg/ml的志愿者中有83％（12人當(dāng)中有10人）在到達(dá)3.6 km海拔高度的高原環(huán)境后發(fā)生AMS;而唾液中CRH水平的閩值為21 pg/ml，血漿和唾液中CRH水平

19、存在線性相關(guān)，血漿CRH在50.33 pg/ml時(shí)對(duì)應(yīng)的唾液CRH值為20.8 pg/ml。在另一組到達(dá)5.5km海拔高度的高原環(huán)境的志愿者中，基礎(chǔ)血漿CRH水平在大于或等于49.16pg/ml有81％（16人當(dāng)中有13人）發(fā)生AMS。
　　結(jié)論：
　　高原低氧高度和時(shí)間依賴性地刺激大鼠下丘腦PVN區(qū)CRH合成和分泌，上調(diào)不同腦區(qū)和垂體CRHR1 mRNA的表達(dá)，抑制CRHR2 mRNA的表達(dá)，激活皮層細(xì)胞促凋亡基因bnip

20、3，bim，bax的表達(dá)和caspase-3活性的增加，當(dāng)輕度低氧時(shí)，促進(jìn)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，嚴(yán)重低氧則抑制bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)皮層細(xì)胞凋亡增加，CRHR1拮抗劑可逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提示低氧腦損傷與CRHR1的過度激活有關(guān)。低氧強(qiáng)度和時(shí)間依賴性的增加大鼠血漿CRH的水平，而與腦CRH水平呈負(fù)相關(guān)，與大鼠血漿皮質(zhì)酮水平呈正相關(guān)，提示血漿CRH來源于下丘腦中樞的分泌，CRH以及CRHR1是低氧應(yīng)激下腦損傷HPA的標(biāo)志分子。<

21、br>　　人體耗竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)機(jī)體低氧，升高血漿和唾液CRH及皮質(zhì)醇水平，唾液CRH水平和血漿CRH水平有很好的線性相關(guān)，由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明唾液腺不含CRH神經(jīng)元，提示唾液CRH來源于血液循環(huán)。此外，高原低氧暴露后血漿和唾液CRH同時(shí)升高，發(fā)生AMS的志愿者中具有高的CRH水平，提示高水平的CRH可能與AMS發(fā)生相關(guān)。唾液和血漿CRH可作為中樞CRH/CRHR1激活的標(biāo)志分子和AMS的發(fā)生密切相關(guān)，提示特異的CRHR1抑制劑可能成為治療或預(yù)防