突觸蛋白-Ⅰ在胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)分化和移植治療腦缺血中的作用.pdf

1、研究背景和目的 近年來(lái)，再生醫(yī)學(xué)給腦缺血帶來(lái)了新的希望。胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ESC)由于具有很強(qiáng)的增殖和分化能力、可被大量地誘導(dǎo)成為神經(jīng)細(xì)胞而成為再生醫(yī)學(xué)移植供體的理想來(lái)源。由于ESC直接移植體內(nèi)具有形成畸胎瘤的危險(xiǎn)，因此應(yīng)用ESC治療腦缺血一般先在體外誘導(dǎo)分化出神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，然后再移植進(jìn)腦內(nèi)。也就是說(shuō)ESC治療腦缺血的過(guò)程分為兩部分，一是體外誘導(dǎo)ESC向神經(jīng)細(xì)胞的分化，一是移植進(jìn)腦內(nèi)的ES

2、C的遷移、增殖以及與宿主腦組織的整合。細(xì)胞分化是細(xì)胞特異基因在時(shí)間和空間上序貫性表達(dá)的結(jié)果，即哪些基因被激活和在什么時(shí)間與位點(diǎn)被激活，因此ESC向神經(jīng)細(xì)胞的分化有著極其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。同樣地，ESC在宿主腦內(nèi)的遷移、增殖和整合也受著自身機(jī)制和宿主機(jī)制的雙重調(diào)控。因此尋求這一過(guò)程的可調(diào)控點(diǎn)或調(diào)控切入點(diǎn)是更好地應(yīng)用ESC治療腦缺血的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。突觸蛋白-Ⅰ(synapsin-Ⅰ)是一個(gè)有代表性的與突觸囊泡相關(guān)的磷酸蛋白，在神經(jīng)的早期發(fā)育分化和

3、神經(jīng)遞質(zhì)釋放的過(guò)程中起著重要的作用。我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)synapsin-Ⅰ在腦缺血再灌流后存在表達(dá)的變化。既然synapsin-Ⅰ與神經(jīng)分化和腦缺血均密切相關(guān)，我們把synapsin-Ⅰ作為誘導(dǎo)ESC分化為神經(jīng)細(xì)胞移植治療腦缺血這一過(guò)程的可調(diào)控點(diǎn)或調(diào)控切入點(diǎn)的候選基因。通過(guò)研究synapsin-Ⅰ在ESC的神經(jīng)分化及其移植治療腦缺血這一過(guò)程的作用，驗(yàn)證synapsin-Ⅰ可否成為這一過(guò)程的可調(diào)控點(diǎn)或調(diào)控切入點(diǎn)，為進(jìn)一步研究這一過(guò)程的調(diào)

4、控機(jī)制提供依據(jù)。 方法 1.采用五步法和維甲酸法兩種不同的途徑體外誘導(dǎo)ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化，并以另一種可向神經(jīng)細(xì)胞分化的腫瘤細(xì)胞——PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)過(guò)程作參照，從不同的途徑、不同的細(xì)胞進(jìn)行比較，通過(guò)免疫組織化學(xué)、RT-PCR、western-blot方法觀察這一過(guò)程synapsin-Ⅰ的表達(dá)變化，找出synapsin-Ⅰ在誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)變化的共同規(guī)律。 2.于不同誘導(dǎo)階段采用反義寡核苷酸技術(shù)抑

5、制ESC和PC12細(xì)胞的synapsin-Ⅰ表達(dá)，比較抑制與不抑制的形態(tài)學(xué)、分化效率及其它神經(jīng)特異性蛋白表達(dá)的變化，觀察這種干預(yù)對(duì)細(xì)胞的神經(jīng)分化過(guò)程的影響。 3.建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型和PC12細(xì)胞缺氧+血清剝奪模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察短暫腦缺血/缺氧+血清剝奪，再灌流/復(fù)給氧+血清后突觸蛋白-Ⅰ的表達(dá)變化規(guī)律。 4.采用transwell小室共培養(yǎng)ESC和遭受缺血缺氧打擊的已分化的PC12細(xì)胞，模

6、擬ESC移植遷移的過(guò)程，建立ESC移植治療腦缺血的離體模型。采用Hoechst染色法和流式細(xì)胞儀計(jì)算ESC的遷移率，比較分化與未分化ESC的遷移能力、受缺血缺氧打擊與未受缺血缺氧打擊PC12細(xì)胞對(duì)ESC的吸引力；然后采用反義寡核苷酸技術(shù)抑制ESC的synapsin-Ⅰ表達(dá)，觀察抑制后ESC遷移能力和形態(tài)學(xué)的改變。 結(jié)果 1.結(jié)合形態(tài)學(xué)和其它神經(jīng)特異性指標(biāo)的變化，synapsin-Ⅰ在ESC和PC12細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)

7、程中具有早期即有表達(dá)，后逐漸升高，至分化成熟階段達(dá)最高，后期又逐漸下降的變化規(guī)律。 2.于不同誘導(dǎo)分化階段抑制synapsin-Ⅰ的表達(dá)均可導(dǎo)致ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化的進(jìn)程較正常滯后和神經(jīng)分化效率的降低，以早期分化階段明顯。第三、四階段抑制synapsin-Ⅰ的表達(dá)導(dǎo)致第三、四階段末神經(jīng)前體細(xì)胞(nestin陽(yáng)性細(xì)胞)比例較正常分化明顯減少(第三階段末：76.2±5.1％VS68.5±4.2％，P＜0.05，第四階段末：90.2±

8、4.3％VS75.1±4.7％，P＜0.01)，細(xì)胞的突起伸長(zhǎng)速度減慢。第五階段抑制synapsin-Ⅰ的表達(dá)導(dǎo)致第五階段末神經(jīng)元樣細(xì)胞、MAP2陽(yáng)性細(xì)胞的比例減少(41.2±2.7％VS30.7±3.2％，P＜0.05)，細(xì)胞之間的聯(lián)系減少。 抑制PC12細(xì)胞synapsin-Ⅰ的表達(dá)后也出現(xiàn)整個(gè)分化過(guò)程滯后的情況，大部分細(xì)胞突起較正常誘導(dǎo)分化過(guò)程短，誘導(dǎo)1d、4d、7d、10d分化細(xì)胞的百分率由正常分化過(guò)程的1.81±0.4

9、0％、45.13±4.17％、90.26±4.68％、84.66±4.81％降至0.33±0.46％、9.78±3.47％、45.3±7.98％、34.2±5.89％，轉(zhuǎn)染組與正常分化組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)。 3.MCAO模型和PC12細(xì)胞缺氧模型均顯示短暫腦缺血/缺氧，再灌流/復(fù)給氧12h內(nèi)synapsinⅠ的表達(dá)無(wú)明顯變化，再灌流/復(fù)給氧后24h降低(P＜0.01)，至72h恢復(fù)至對(duì)照組水平。 4.遭

10、受缺氧缺血打擊后的PC12細(xì)胞比未遭受缺氧缺血打擊的PC12細(xì)胞更能吸引ESC的遷移，遷移向缺血PC12細(xì)胞的ESC比遷移向未缺血的PC12細(xì)胞增多68％以上甚至數(shù)倍。 抑制synapsin-ⅠmRNA的表達(dá)后，ESC的遷移細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染前明顯減少(P＜0.05)。 PC12細(xì)胞遭受缺血打擊后24h移植的未分化和已分化ESC遷移數(shù)明顯高于立即移植的ESC遷移數(shù)，兩者的比值分別為1.97和2.04。 結(jié)論

11、1.synapsin-Ⅰ在ESC的體外神經(jīng)分化過(guò)程中起著重要的作用，而且在分化的不同階段所起的作用不同，在分化的早期可能起著更為重要的作用。 2.在ESC移植治療腦缺血的離體研究中、ESC的遷移數(shù)受宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響，并可能與ESC自身和宿主細(xì)胞的synapsin-Ⅰ的表達(dá)水平有關(guān)。 3.synapsin-Ⅰ可能參與了ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化及移植治療腦缺血過(guò)程的調(diào)控機(jī)制，有望成為這一過(guò)程的理想調(diào)控點(diǎn)或調(diào)控切入點(diǎn)。