Junctophilin3和4在胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化早期作用研究.pdf

1、Junctophilin3(JP3)和Junctophilin4(JP4)在大腦皮層、海馬及小腦高表達(dá)，是一類存在于可興奮細(xì)胞中的膜結(jié)合蛋白。JP3，4能夠連接細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，形成膜連接復(fù)合物，對維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Jp3,4基因雙敲除的小鼠出生后不但出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育遲緩及致死率高，而且呈現(xiàn)記憶認(rèn)知功能損傷和運(yùn)動協(xié)調(diào)功能失常，提示這兩種蛋白在維持動物記憶和運(yùn)動功能上起重要作用，并在胚胎神經(jīng)分化發(fā)育過程中的不可或缺性。但

2、其在胚胎發(fā)育過程的表達(dá)變化、功能特征以及功能差異尚未見報(bào)道。JP3，4能否在神經(jīng)分化發(fā)育早期便參與神經(jīng)系統(tǒng)的建立也亟待探索。
　　果蠅表達(dá)的JP同源蛋白Undertaker(UTA)，能通過維持吞噬細(xì)胞內(nèi)Ca+平衡來參與凋亡細(xì)胞的清理。神經(jīng)分化過程伴隨大量細(xì)胞凋亡，未被及時(shí)清理的凋亡細(xì)胞則會發(fā)生二次壞死，導(dǎo)致細(xì)胞毒性并影響軸突的生長。凋亡的細(xì)胞會釋放出“find-me”信號，快速吸引周圍的細(xì)胞遷移，同時(shí)也會暴露出“eat-me”信

3、號，保證吞噬細(xì)胞的識別和吞噬。然而，哺乳動物神經(jīng)組織JPs是否也具有相同的功能迄今未見報(bào)道。除了需要嚴(yán)格和適宜的外部環(huán)境，神經(jīng)元極化及軸突生長還受胞外信號的調(diào)控。凋亡細(xì)胞能夠召喚周圍細(xì)胞的增殖，但是否能對神經(jīng)極化以及軸突生長產(chǎn)生影響尚未見報(bào)道。同時(shí)，JP3，4在連接凋亡、吞噬及神經(jīng)極化之間扮演的角色也亟待闡明。
　　在神經(jīng)發(fā)育初期，未分化的突起通過競爭，最終只形成單一的軸突，而其他的突起將會停止生長或者變成樹突，該過程使神經(jīng)元在形

4、態(tài)和功能上都形成了極化。神經(jīng)元的極化及生長需要局部的Ca2+信號和cAMP，形成局部極化。通過TRPC內(nèi)流的Ca2+能夠啟動軸突的特化，并激活下游CaMKI等級聯(lián)信號，促使軸突形成。而在軸突切斷的外周神經(jīng)中，鈣波會沿著軸突傳向胞體，啟動軸突的再生。此外，Ca2+信號還可以和cAMP通路相互作用形成正反饋，放大cAMP信號。在諸多突起中，cAMP濃度最高的突起能夠通過正反饋不斷提升內(nèi)部cAMP濃度，促使該突起長成軸突，而剩下突起則長成樹突

5、。然而，胞內(nèi)cAMP信號如何被喚起，Ca2+信號如何在局部區(qū)域被精準(zhǔn)調(diào)控，基于JP3，4維持的胞內(nèi)Ca2+平衡是否與此相關(guān)聯(lián)尚未完全明確。本論文第一部分將對以上問題做出探索。
　　在軸突和樹突的生長過程，會有過量的軸突分支、突觸以及樹突樹形成，在形成神經(jīng)環(huán)路后，多余的軸突分支將會被選擇性修剪，以保證神經(jīng)信號傳遞的專一性。吞噬受體Megf10能夠參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的修剪與重塑，Megf10敲除小鼠則保留了過多數(shù)量的突觸。果蠅Me

6、gf10的同源蛋白Draper已被發(fā)現(xiàn)能夠參與果蠅胚胎發(fā)育過程的吞噬，而UTA則與Draper協(xié)同完成這一事件。因此，本論文第二部分（附）探索了JP3，4能否在胚胎干細(xì)胞分化神經(jīng)過程中參與軸突的修剪及重塑。
　　Junctophilin-3，-4連接吞噬參與神經(jīng)極化作用研究
　　本論文第一部分考察了JP3，4參與神經(jīng)極化的分子機(jī)制，探索JP3，4正常表達(dá)與Ca+/cAMP形成局部極化的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JP3，4在ES細(xì)

7、胞定向分化神經(jīng)元早期有一過性高表達(dá)。在ES細(xì)胞沉默Jp3和Jp4，其神經(jīng)分化早期表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致Ca2+/cAMP極化正反饋通路受破壞，進(jìn)而抑制神經(jīng)極化。抑制JP3，4早期表達(dá)高峰使神經(jīng)前體細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+分布失去空間特異性，并導(dǎo)致Ca2+瞬變能力顯著減弱，同時(shí)cAMP含量明顯下降，cAMP-LKB1-SAD/MARK2極化通路激活受阻。提示JP3，4早期高表達(dá)對維持神經(jīng)前體細(xì)胞胞內(nèi)局部Ca2+/cAMP極化正反饋通路有重要作用。與此

8、同時(shí)，ES細(xì)胞定向分化神經(jīng)早期JP3，4一過性高表達(dá)尚與吞噬作用密切相關(guān)。神經(jīng)分化過程伴隨大量凋亡，抑制JP3，4早期表達(dá)致使神經(jīng)前體細(xì)胞清理凋亡細(xì)胞的效率顯著下降。提示JP3，4在凋亡細(xì)胞清理過程需要被大量表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，JP3，4能夠感應(yīng)凋亡細(xì)胞的信號。凋亡細(xì)胞的刺激可快速提高JP4及吞噬受體Megf10的表達(dá)水平，并可促進(jìn)JP3與RyR2、RyR3的結(jié)合，同時(shí)，JP4與Megf10的結(jié)合也顯著上調(diào)。這些結(jié)果提示，除了維持內(nèi)質(zhì)

9、網(wǎng)與細(xì)胞膜的空間距離，JP3與JP4在功能上各有分工，可分別通過JP3-RyR2，3相互作用及JP4-Megf10相互作用參與吞噬，保證神經(jīng)極化適宜的微環(huán)境。最后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞刺激可顯著提升胞內(nèi)cAMP的含量并激活cAMP-LKB1-SAD/MARK2極化通路，促進(jìn)神經(jīng)元極化。更為重要的是，凋亡細(xì)胞的刺激能夠提升神經(jīng)前體細(xì)胞胞漿Ca2+瞬變能力，易化神經(jīng)前體細(xì)胞極化。該結(jié)果提示神經(jīng)分化發(fā)育過程，凋亡細(xì)胞可與神經(jīng)前體細(xì)胞建立聯(lián)系

10、，不僅可誘導(dǎo)其吞噬，同時(shí)也能分泌信號促進(jìn)神經(jīng)極化及軸突生長，而JP3，4在其中起著橋梁作用。
　　附:JP3，4參與神經(jīng)分化過程軸突修剪研究
　　本論文第二部分初步探索了JP3，4在神經(jīng)分化過程參與軸突修剪。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過慢病毒沉默吞噬受體Megf10可導(dǎo)致d8+0 JP3的表達(dá)下降，而JP4的表達(dá)上調(diào)。而沉默JP3則導(dǎo)致Megf10的表達(dá)上調(diào)，沉默JP4導(dǎo)致Megf10的表達(dá)輕微下調(diào)，同時(shí)沉默JP3，4則會上調(diào)Megf

11、10的表達(dá)。結(jié)合第一部分JP3，4與Megf10的免疫共沉淀結(jié)果，提示JP3，4與Megf10之間存在調(diào)控關(guān)系。在d8+5用凋亡細(xì)胞刺激可提升JP4以及Megf10的表達(dá)。免疫熒光及電鏡結(jié)果表明，在d8+5，細(xì)胞的吞噬能力更強(qiáng)，能夠同時(shí)吞噬2-3個(gè)凋亡細(xì)胞或者細(xì)胞碎片。此外，神經(jīng)元之間被發(fā)現(xiàn)存在相互聯(lián)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)分化d8+5，β-tubulinⅢ碎片被包裹于Megf10陽性的細(xì)胞中。同時(shí)，三維重構(gòu)的結(jié)果也顯示JP3，4陽性

12、的細(xì)胞也能吞噬軸突碎片（β-tubulinⅢ陽性）。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，神經(jīng)元陽性的細(xì)胞不會參與吞噬，而JP3，4及Megf10則大部分分布在神經(jīng)元陽性細(xì)胞以及神經(jīng)前體陽性細(xì)胞中，提示可能有表達(dá)JP3，4的膠質(zhì)前體細(xì)胞參與軸突修剪。
　　結(jié)論:
　　1.ES細(xì)胞分化神經(jīng)前體細(xì)胞過程，凋亡細(xì)胞能吸引吞噬細(xì)胞觸發(fā)其吞噬作用，并促未成熟神經(jīng)突極化。JP3和JP4在該過程維持胞內(nèi)Ca2+平衡并耦聯(lián)這兩個(gè)關(guān)鍵事件，確保神經(jīng)突極化的完