胚胎干細(xì)胞多次移植對(duì)博萊霉素致小鼠肺損傷的治療作用.pdf

1、許多伴有不同程度肺部炎癥和纖維化的急性或慢性肺部疾病都被列入間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)的范疇，特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonaryfibrosis，IPF)是其常見(jiàn)類(lèi)型。美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(ATS)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)(ERS)推薦的聯(lián)合治療包括皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺，但目前臨床上缺乏足夠證據(jù)說(shuō)明其有效性。由于IPF缺乏有效的治療措施，患者生存期平均僅2-3年，因此探索新的有

2、效治療方法是擺在醫(yī)學(xué)工作者面前的緊迫而又艱巨的任務(wù)。本研究在本科前期研究的基礎(chǔ)上，嘗試S8-胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，S8-ESC)多次移植以觀察其對(duì)博萊霉素致小鼠肺損傷的治療作用，并探討其作用機(jī)理，為日后臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。 第一部分：預(yù)實(shí)驗(yàn) 目的：1.對(duì)比幾種不同劑量的博萊霉素對(duì)小鼠肺纖維化模型的效果，探尋出一種較為合理可靠小鼠造模劑量。2.小批量探索不同數(shù)量的S8-ESC移植對(duì)博萊

3、霉素致小鼠肺損傷的治療作用，探尋出最佳移植數(shù)量。3.小批量對(duì)比不同的S8-ESC移植的間隔時(shí)間和次數(shù)，探索最佳間隔時(shí)間和次數(shù)。 方法：1.將所有小鼠隨機(jī)分成四組，博萊霉素1組(BLM-1組)(n=15)給予氣管內(nèi)注射2mg·kg-1的博萊霉素，BLM-2組(n=15)給予氣管內(nèi)注射3.5mg·kg-l的博萊霉素，BLM-3組(n=15)給予氣管內(nèi)注射5.0mg·kg-1的博萊霉素，對(duì)照組(n=15)，氣管內(nèi)注射相同體積的生理鹽水

4、，所有小鼠于造模后第28天處死。觀察其在28天內(nèi)的存活情況，并取其左肺葉制作病理切片，光鏡觀察肺部炎癥和纖維化程度；取右肺葉做羥脯氨酸測(cè)定。2.將21只小鼠分空白對(duì)照組(n-2)、氣管滴入生理鹽水并經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；博萊霉素組(n=4)經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；治療組-1( n=5)尾靜脈注射1.0×105的上皮祖細(xì)胞；治療組-2(n=5)注射1.0×106的上皮祖細(xì)胞；治療組-3(n=5)注射1.0×107的上皮祖細(xì)胞。觀察指標(biāo)：小鼠

5、生存時(shí)間、肺組織病理變化、肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定和肺組織勻漿中的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)和γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)含量。3.將66只小鼠分連續(xù)、隔日和三日移植大組，每個(gè)大組有分空白對(duì)照組(n=2)、博萊霉素組(n=4)和4個(gè)治療組(n=16)。對(duì)照組和博萊霉素組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水，4個(gè)治療組分別注射1-4次1.0×107的上皮祖細(xì)胞。

6、觀察指標(biāo)：小鼠生存時(shí)間、肺組織病理變化、肺組織羥脯氨酸含量的測(cè)定、肺組織勻漿中的細(xì)胞因子TGF-β1和IFN-γ含量和肺組織β-半乳糖苷酶原位染色。 結(jié)果：1.肺纖維化程度由重到輕依次為BLM-3組、BLM-2組、BLM-1組，對(duì)照組無(wú)異常變化。死亡率由高到低依次為：BLM-3組(93.3％)、BLM-2組(73.3％)、BLM-1組(60.0％)。2.肺纖維化程度由重到輕依次為博萊霉素組、治療組-1、治療組-2、治療組-3，對(duì)

7、照組無(wú)異常變化。死亡率、肺組織羥脯氨酸和TGF-β1的含量由高到低依次為：博萊霉素組、治療組-1、治療組-2、治療組-3和對(duì)照組，而IFN-γ除對(duì)照組外，其他組則相反。3.肺纖維化程度由重到輕依次為博萊霉素組、治療組-1、治療組-2、治療組-3和治療組-4，對(duì)照組無(wú)異常變化，在三個(gè)大組中，隔日移植組的減輕較連續(xù)和三日移植組明顯。死亡率、肺組織羥脯氨酸和TGF-β1的含量由高到低依次為：博萊霉素組、治療組-1、治療組-2、治療組-3、治療

8、組-4和對(duì)照組，而IFN-γ則相反。在三個(gè)大組中，隔日移植組的增高或減低較連續(xù)和三日移植組明顯。在28天時(shí)各組肺組織β-半乳糖苷酶原位染色均陰性，但移植次數(shù)越多，上皮祖細(xì)胞在肺內(nèi)停留的時(shí)間就越長(zhǎng)。 初步結(jié)論：1.經(jīng)氣管注射博萊霉素制作小鼠肺纖維化模型應(yīng)兼顧造模效果和動(dòng)物的存活率綜合考慮，3.5mg·kg-1是較為理想的小鼠造模劑量。2.S8-ESC誘導(dǎo)分化而來(lái)的上皮祖細(xì)胞可減輕博萊霉素致小鼠的肺損傷，其療效隨著移植數(shù)量(105-

9、107)和移植次數(shù)的增加而作用更顯著，隔日移植組作用最明顯。3.作用機(jī)制可能與上皮祖細(xì)胞對(duì)TGF-β1和IFN-γ等細(xì)胞因子的影響有關(guān)。 第二部分：正式實(shí)驗(yàn) 目的：擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討和驗(yàn)證S8-ESC多次移植對(duì)博萊霉素所致小鼠肺組織損傷的治療作用和作用機(jī)制。 方法：C57BL/6J小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、治療組－1、治療組－2、治療組-3和治療組-4，每組各10只。除對(duì)照組外，其余5組

10、均經(jīng)氣管給予博萊霉素制作肺損傷模型，將S8-ESC誘導(dǎo)分化而來(lái)的上皮祖細(xì)胞，分別經(jīng)尾靜脈注入4個(gè)治療組小鼠體內(nèi)1-4次，對(duì)照組和模型組注射等體積的生理鹽水，28天后觀察6組小鼠生存時(shí)間，肺組織病理學(xué)變化，檢測(cè)肺組織羥脯氨酸含量及肺組織勻漿中TGF-β1、IFN－γ、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases，MMP-9)及其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors ofmetallopro

11、teinase，TIMP-1)含量，并用β－半乳糖苷酶原位染色方法檢測(cè)肺組織中上皮祖細(xì)胞定植情況。 結(jié)果：上皮祖細(xì)胞植入28天后，1、各組小鼠死亡率：對(duì)照組無(wú)死亡，模型組60％，治療組－150％，治療組－240％，治療組－340％，治療組－420％。模型組和4個(gè)治療組生存曲線明顯分開(kāi)。在4個(gè)治療組中，除相鄰兩個(gè)生存曲線部分重疊外，其余治療組間的生存曲線彼此分開(kāi)；2、各組肺組織羥脯氨酸含量：對(duì)照組0.390±0.027μg/mg，

12、模型組0.748±0.043μg/mg，治療組-10.674±0.071μg/mg，治療組-20，604±0.027μg/mg，治療組-30.554±0.050μg/mg，治療組-40.509±0.034μg/mg，各組之間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3、各組肺組織勻漿中IFN-γ量和TGF-β1含量分別為：對(duì)照組53.889±16.052 pg/mg和15.770±3.112 ng/mg，模型組142.247±99.564

13、pg/mg和53.135±9.513 ng/mg，治療組-1188.645±43.491pg/mg和40，946±5.881ng/mg，治療組-2289.102±55，243 pg/mg和36.016±6.290 ng/mg，治療組-3339.512±82.648 pg/mg和34.871±4.929 ng/mg，治療組－4517.198±138.608 pg/mg和28.041±7.248 ng/mg，治療組－2和治療組-3肺組織勻漿

14、中IFN-γ含量和TGF-β1含量均有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組之間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMP-9和TIMP-1除各組與對(duì)照組比較外，其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4、各組肺組織病理切片HE染色，肺纖維化程度由重到輕依次為博萊霉素組、治療組-1、治療組-2、治療組-3、治療組-4和對(duì)照組，博萊霉素組和治療組-1之間平均秩次有差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組之間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5、隨著移植上皮祖