藥物干預(yù)對(duì)吸煙誘導(dǎo)COPD大鼠模型作用的研究.pdf

1、[目的]建立大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型，觀察N-乙酰半胱氨酸(NAC)、布地奈德，茶堿單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)COPD氧化還原反應(yīng)、核因子-κB(NF-κB)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)血液和肺內(nèi)表達(dá)的影響，探討單藥與聯(lián)合用藥對(duì)吸煙導(dǎo)致COPD作用是否存在差異；探討ROS、NF-κB和HAT/HDAC在COPD發(fā)病中的作用，以期為闡明COPD的發(fā)病機(jī)制和COPD的治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。 [方法]36只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)

2、分為健康對(duì)照組(C)、COPD模型組(M)、NAC干預(yù)組(N)、布地奈德干預(yù)組(B)、NAC加布地奈德干預(yù)組(NB)、布地奈德組加茶堿干預(yù)組(BT)，每組均為6只。采用熏香煙加氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型。NAC組于COPD模型開(kāi)始建立時(shí)予NAC(400mg/kg)胃飼，每日1次，每次2ml；B組于COPD模型建立時(shí)于布地奈德霧化吸入每日1次，該組每次吸入2mg/2ml；NB組于第8日起加布地奈德霧化吸入，劑量同上；

3、BT組于COPD模型建立時(shí)于給予茶堿；各組均連續(xù)用藥4周。COPD模型建立后，觀察內(nèi)容如下： 1、光鏡下觀察肺部病理學(xué)變化。 2、支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。 3、分光光度法測(cè)定血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。 4、活性氧測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中抗活性氧單位量。 5、免疫組化法觀察肺內(nèi)、核因子-κB(NF-κB)、組蛋白去乙?；?HDAC)的表達(dá)情況。

4、6、RT-PCR測(cè)定肺組織中HDAC基因表達(dá)的情況。 7、掃描電鏡觀察氣道粘膜表面及肺泡超微結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)。 [結(jié)果] 1、所建大鼠COPD模型的病理組織學(xué)改變符合人類COPD的特點(diǎn)。各COPD造模組氣管、支氣管及肺組織有慢性氣管炎、阻塞性肺氣腫的特征性病理改變。光鏡下觀察蘇木素/伊紅(HE)染色切片，肺氣腫模型組肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴(kuò)張肺泡壁變薄，并有不同程度的斷裂。NAC組、NB組、BT組大鼠肺泡壁斷裂和肺

5、泡腔擴(kuò)張情況明顯減輕；與正常對(duì)照組比較，COPD模型組和B組平均內(nèi)襯間隔(MLI)顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05)，平均肺泡數(shù)(MAN)顯著較少，差異有顯著性(P＜0.05)；與COPD模型組比較，NAC干預(yù)組、NB組大鼠MLI顯著較少，差異有顯著性(P＜0.05)，MAN顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05)。 2、各組BALF中有核細(xì)胞總數(shù)及分類與對(duì)照組相比，模型組、NAC組、NB組、B組及BT組BALF白細(xì)胞總數(shù)及中

6、性粒細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)顯著增加，差異有顯著性(P＜0.01)；單核巨噬細(xì)胞所占構(gòu)成比顯著降低，差異有顯著性(P＜0.01)，但其絕對(duì)數(shù)則增加。與模型組比較，NAC組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類構(gòu)成比與COPD模型組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)；NB組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞較NAC組顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，肺泡巨噬細(xì)胞所占比例明顯高于NAC組，差異有顯著性(P＜0.05)。B組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及分類構(gòu)成比與COPD

7、模型組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)；BT組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞較COPD組顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，較B組無(wú)明顯變化(P＞0.05)。 3、血清中SOD、Anti-ROS、MDA含量與對(duì)照組相比，模型組、NAC組、B組及BT組血清中SOD含量明顯降低差異有顯著性，(P＜0.05)，血清抗活性氧單位明顯降低，差異有顯著性(P＜0.05)，MDA明顯增高，差異有顯著性(P＜0.05)；NB組則與對(duì)照組無(wú)明

8、顯差異(P＞0.05)。 4、組織NF-κB、HDAC2的表達(dá) NF-κB免疫組化結(jié)果：NF-κB可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，正常對(duì)照組呈弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)。COPD模型組與正常對(duì)照組比較，NF-κB呈強(qiáng)陽(yáng)性免疫反應(yīng)，COPD模型組陽(yáng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)含量較正常對(duì)照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)。NAC治療組，明顯高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.01)。NB組NF-κB在胞核、

9、胞漿中表達(dá)則呈弱陽(yáng)性。NB組NF-κB在胞核、胞漿中表達(dá)呈弱陽(yáng)性到陽(yáng)性表達(dá)，NB組與NAC組比較，NF-κBP65在胞核中陽(yáng)性反應(yīng)明顯減輕，差異有顯著性(P＜0.05)。B組NF-κB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度與正常對(duì)照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)，與COPD模型組則無(wú)明顯差異(P＞0.05)；BT組NF-κB在胞核、胞漿中均呈陽(yáng)性反應(yīng)，較B組明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。 HDAC2免疫組化結(jié)果：HDAC2

10、可表達(dá)于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，正常對(duì)照組呈陽(yáng)性免疫反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物多分布在核中，胞漿中極少見(jiàn)陽(yáng)性免疫反應(yīng)物質(zhì)。COPD模型組HDAC2呈弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)，HDAC2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度與正常對(duì)照組比較明顯降低，差異有顯著性(P＜0.01)，與NAC治療組下降不明顯(P＞0.05)，與NB組比較明顯下降，差異有顯著性(P＜0.05)。NAC治療組HDAC2在胞核中呈陽(yáng)性反應(yīng)，其陽(yáng)性百分率表達(dá)與健康對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

11、NB組HDAC2在胞核表達(dá)呈陽(yáng)性表達(dá)。NB組與正常對(duì)照組比較，HDAC2在胞核中陽(yáng)性反應(yīng)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；與NAC治療組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。B組HDAC2呈弱陽(yáng)性免疫反應(yīng)，與對(duì)照組比較顯著降低，差異有顯著性(P＜0.01)，與COPD模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；BT組HDAC2呈陽(yáng)性免疫反應(yīng)，與對(duì)照組比較顯著降低，差異有顯著性(P＜0.05)，與COPD模型組比較顯著增加，差異有顯著性(P＜0.05

12、)，與B組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 5、RT-PCR測(cè)定肺組織中HDACmRNA使用AlphaInnotech軟件分析，讀取各條帶光密度，其中β-actin的光密度固定為26.71，求出各組HDAC2與β-actin的光密度值比值，代表HDAC2mRNA表達(dá)情況。COPD模型組、B組、NB組、NAC組和BT組的HDAC2Mrna表達(dá)量都明顯高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P＜0.01)，除COPD模型組和B組間無(wú)顯著性差

13、異(P＞0.05)，其他各組間均有顯著性差異(P＜0.01)。 5、支氣管粘膜掃描電鏡觀察COPD模型組及B組大鼠支氣管柱狀上皮細(xì)胞纖毛成大片倒伏，凌亂，失去正常形態(tài)，有廣泛區(qū)域纖毛脫落；杯狀細(xì)胞肥大，增生明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。正常對(duì)照組大鼠支氣管柱狀上皮細(xì)胞纖毛排列規(guī)則，呈“麥浪”起伏狀，杯狀細(xì)胞飽滿無(wú)增生，無(wú)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。NAC干預(yù)組、NB組及BT組大鼠支氣管柱狀上皮細(xì)胞纖毛部分倒伏，部分區(qū)域出現(xiàn)纖毛脫落；杯狀細(xì)胞輕度增生

14、，輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；但NAC干預(yù)組、NB組和BT組間無(wú)明顯差異。 [結(jié)論]1吸煙可引起體內(nèi)抗氧化能力的下降，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的增加，NF-κB的強(qiáng)烈表達(dá)，組蛋白乙?；皆黾樱琀DAC的抑制和破壞，引起肺部炎癥反應(yīng)和激素抑制，改變肺部氧化還原平衡，引起COPD發(fā)病。 2NAC可以抗氧化、減弱炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB在肺組織的表達(dá)，降低吸煙對(duì)HDAC的抑制和破壞，增加組蛋白的乙?；?。 3布地耐德在減弱肺部炎癥、抑制N