牽張應(yīng)力對MC3T3-E1和人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響及相關(guān)信號通路調(diào)控作用研究.pdf

1、應(yīng)力刺激是調(diào)節(jié)骨代謝、維持骨量和骨功能結(jié)構(gòu)的重要因素之一。應(yīng)力狀態(tài)下的牙周組織改建是口腔正畸臨床矯治的生物學(xué)基礎(chǔ)，在機械應(yīng)力刺激下，通過對牙周膜細(xì)胞以及成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，最終實現(xiàn)正畸牙齒的移動，同時維持牙槽骨組織應(yīng)力改建的平衡。目前盡管人們對成骨細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞的力學(xué)生物反應(yīng)進(jìn)行了大量的研究，包括其增殖、分化，功能狀態(tài)、成骨或破骨相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，但成骨細(xì)胞或牙周膜細(xì)胞對應(yīng)力刺激的識別機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、生

2、物響應(yīng)機制等還并不十分清楚，尤其是對其生物力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)機制以及不同信號通路之間相互作用及相互關(guān)系知之甚少。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase1/2，ERK1/2)信號通路和核因子κB(NuclearfactorkappaB,NF-κB)信號通路是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中兩條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在成骨前體細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。因此本研究通過MC3T3-E

3、1成骨樣細(xì)胞以及人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)，通過建立細(xì)胞體外牽張應(yīng)力加載模型，觀察牽張應(yīng)力對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞或人牙周膜細(xì)胞成骨分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響，了解牽張應(yīng)力對ERK1/2與NF-kB信號通路的影響及兩條通路之間的相互作用關(guān)系。
　　實驗一：牽張應(yīng)力對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　本研究通過MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞體外培養(yǎng)，觀察不同大小牽張應(yīng)力刺激后，堿性磷酸酶(alkalinephos

4、phatase,ALP)、I型膠原（COLⅠ）、骨保護(hù)素(osteocalcin,OCN)、白細(xì)胞介素-6等基因表達(dá)的變化，研究發(fā)現(xiàn)，在8％及12％細(xì)胞形變率的周期性牽張應(yīng)力作用下，MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性及骨保護(hù)素(osteocalcin,OCN)基因的表達(dá)明顯降低，而ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志，OCN是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志。結(jié)果表明，MC3T3-E1細(xì)胞在8％及12％細(xì)胞

5、形變率的周期性牽張應(yīng)力作用24小時后抑制了其向成熟的成骨細(xì)胞分化的能力。同時研究發(fā)現(xiàn)，牽張應(yīng)力作用24小時后，I型膠原（COLⅠ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因表達(dá)顯著增加。而COLⅠ是構(gòu)成骨組織細(xì)胞外基質(zhì)主要成分之一，說明早期的應(yīng)力刺激可以促進(jìn)骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的合成，是骨組織應(yīng)力改建的物質(zhì)基礎(chǔ)。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，參與了正畸牙齒移動過程中牙周組織的改建，并作為一種有效的破骨細(xì)胞活化因子，刺激破骨細(xì)胞的生成和骨吸收活動。<

6、br>　　實驗二：牽張應(yīng)力介導(dǎo)ERK1/2與NF-kB信號通路對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　通過分別給予ERK1/2信號通路和NF-kB信號通路的特異性抑制劑，在基因水平上了解牽張應(yīng)力作用下ERK1/2信號通路和NF-kB信號通路對MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，在12％牽張應(yīng)力作用下，MC3T3-E1細(xì)胞ALP、COLⅠ、IL-6的表達(dá)受ERK1/2信號通路的調(diào)控，而O

7、CN基因表達(dá)的變化不受ERK1/2通路的影響。NF-kB信號通路抑制劑PDTH可顯著抑制機械牽應(yīng)張力作用下MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的降低，同時抑制IL-6基因的表達(dá)，而COLⅠ、OCN基因表達(dá)的變化不受NF-kB信號通路的影響。
　　實驗三：牽張應(yīng)力對MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2與NF-kB信號通路影響的研究
　　通過觀察牽張應(yīng)力對MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ERK1/2與NF-kB通路本身信號分子的

8、反應(yīng)，研究牽張應(yīng)力對MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2與NF-kB信號通路的影響及其相互作用關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞受到12％細(xì)胞形變率的周期性牽張應(yīng)力作用時，ERK1/2信號通路及NF-κB信號通路同時被激活，ERK1/2、IKK磷酸化水平顯著提高，NF-kB（p65）表達(dá)明顯增加，但阻斷NF-κB信號通路并不會影響ERK1/2信號通路的激活。相反當(dāng)阻斷ERK1/2信號通路時NF-kB信號通路激活受抑制，說明ERK1/2位

9、于IKK的上游，ERK1/2可能對IKK的磷酸化起作用。實驗四：牽張應(yīng)力對人牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　通過利用人骨再生基因表達(dá)譜芯片及RealtimeRT-PCR觀察12％形變率牽張應(yīng)力對人牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討牽張應(yīng)力對人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)12％細(xì)胞形變率的周期性牽張應(yīng)力抑制了其成骨分化能力，有21種相關(guān)基因表達(dá)明顯升高，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因及與炎癥活動相關(guān)細(xì)胞因子基因等。實驗結(jié)