輻射與RNA干擾對(duì)MC3T3-E1 Subclone14成骨樣細(xì)胞相關(guān)因子骨鈣素(OCN)影響的初步研究.pdf

1、目的：骨代謝異常對(duì)患者的生活質(zhì)量及疾病控制有一定影響。骨鈣素(OCN)是成骨細(xì)胞活性及分化的指標(biāo)之一,本文旨在對(duì)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞輻射與RNA干擾方法敲減ppGalNAc-T1處理后對(duì)OCN表達(dá)的影響進(jìn)行研究,以判定多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(ppGalNAc—T1)與OCN表達(dá)變化相關(guān)性,從而對(duì)ppGalNAc—T1基因在成骨細(xì)胞活性及分化機(jī)制中的作用及輻射的影響有一初步了解。
　　 方法：⑴對(duì)MC

2、3T3-E1 Subclone14細(xì)胞進(jìn)行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后進(jìn)行MTT測(cè)吸光值,觀察細(xì)胞在5天內(nèi)的增殖情況差異。⑵對(duì)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞進(jìn)行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡差異。⑶對(duì)MC3T3一E1 Subclone14細(xì)胞進(jìn)行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy劑量輻射24h后換液培養(yǎng)至14d,RT-PCR檢測(cè)4

3、d、7d、10d、14d時(shí)ppGalNAc-T1和OCN的表達(dá)差異。⑷設(shè)計(jì)四條可能的ppGalNAc-T1小干擾RNA(siRNA),分別將這四段siRNA插入到RNA干擾載體pGPU6／GFP／Neo中構(gòu)建成四條干擾載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc-T1—1,2,3,4。⑸按最優(yōu)轉(zhuǎn)染體系通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)四條載體轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)抽提RNA,RT-PCR鑒定ppGalNAc

4、-T1基因在轉(zhuǎn)錄水平的改變；篩選出其中一條對(duì)ppGalNAc-T1抑制作用最佳的載體。⑹利用已構(gòu)建并篩選出的載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc-T1轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí)抽提總RNA,RT-PCR鑒定ppGalNAc-T1基因在轉(zhuǎn)錄水平的改變,同時(shí)RT-PCR、Western-Blot分別檢測(cè)OCNmRNA和蛋白表達(dá)量的改變。
　　 結(jié)果：①與空白對(duì)照組比較,0.5Gy、

5、2.0Gy劑量輻射對(duì)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞增殖能力沒(méi)有明顯影響(P>0.05),而1.0Gy劑量輻射對(duì)細(xì)胞增殖能力有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。②與空白對(duì)照組比較,0.5Gy、2.0Gy劑量輻射對(duì)MC3T3-E1 Subclone14凋亡沒(méi)有明顯影響(P>0.05),而1.0Gy劑量輻射對(duì)MC3T3細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用(P<0.05)。③與空白對(duì)照組比較,0.5Gy,1.0Gy及2.0Gy劑量輻射均能上調(diào)OC

6、N和ppGalNAc-T1 mRNA的表達(dá)趨勢(shì),其中1.0Gy組的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。④功構(gòu)建四條ppGalNAc—T1干擾表達(dá)載體。⑤成功篩選出一條對(duì)ppGalNAc—T1基因抑制效率較高的siRNA表達(dá)載體pGPU6／GFP／Neo—sippGalNAc—T1-919。⑥RT-PCR及WesternBlot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了有效干擾載體pGPU6／GFP／Neo-sippGalNAc—T1—919的細(xì)胞,ppGal

7、NAc-T1基因表達(dá)明顯下調(diào),伺時(shí)OCN mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：⑴輻射劑量1.0Gy可顯著促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,上調(diào)OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表達(dá)。⑵成功構(gòu)建ppGalNAc—T1干擾表達(dá)載體。在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法,成功篩選出一條有效的ppGalNAc—T1基因的siRNA載體,繼而轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 Subclone14細(xì)胞,結(jié)果