三維培養(yǎng)條件下動(dòng)態(tài)載荷對(duì)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)影響的研究.pdf

1、研究目的：
　　 本文采用智能材料-壓電陶瓷裝置，通過(guò)檢測(cè)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞分化特異基因表達(dá)探討三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞對(duì)不同力學(xué)強(qiáng)度的生物學(xué)響應(yīng)。
　　 材料與方法：
　　 1.采用冷凍干燥制備不同質(zhì)量比殼聚糖/羥基磷灰石/脫鈣骨基質(zhì)(chitosan/hydroxyapatite/demineralized bone matrix，CS/HA/DBM)復(fù)合支架材料。掃描電鏡(scanning

2、electron microscopy，SEM)觀察其形貌，Micro-CT分析支架的微結(jié)構(gòu)，材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試不同質(zhì)量比CS/HA/DBM復(fù)合材料的壓縮彈性模量和壓縮強(qiáng)度。采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，將成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1直接接種到CS/HA/DBM三維支架材料上，共培養(yǎng)1、3、5、7d，采用MTS方法繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)，SEM、組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài)。選擇后期實(shí)驗(yàn)用材料及最佳加載時(shí)間。
　　 2.采用有限元(finite e

3、lement，F(xiàn)E)分析方法計(jì)算三維(three-dimensional，3D)支架內(nèi)部單個(gè)細(xì)胞所受到的作用力大小及相關(guān)力學(xué)參數(shù)，根據(jù)此數(shù)據(jù)來(lái)優(yōu)化工程化骨組織體外構(gòu)建的力學(xué)刺激條件，采用智能材料-壓電陶瓷對(duì)細(xì)胞-支架材料復(fù)合物進(jìn)行力學(xué)加載。
　　 3.根據(jù)CS/HA/DBM復(fù)合支架材料生物相容性研究結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果，將加載條件設(shè)定為每次1h，1次/d，連續(xù)6d，頻率為1Hz，工作應(yīng)變?yōu)?με、1200με、2800με、70

4、00με，用MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，采用RT-PCR方法測(cè)定特異基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、Runx2或稱(chēng)核心結(jié)合因子(core bindingfactor al，Cbfa1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)及骨鈣素(osteocalcin，OCN)的基因表達(dá)情況，采用WesternBl

5、ot方法測(cè)定BMP-2、Runx2的蛋白表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.通過(guò)冷凍干燥法制備出具有良好相互連通孔隙結(jié)構(gòu)(>100μm)的3D材料。CS/HA/DBM復(fù)合材料具有連通的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為48％-65％，材料的平均壓縮模量和最終壓縮強(qiáng)度分別為3-6 kPa和11-24 kPa。在DBM一定的情況下，隨著HA量的增加，體積分?jǐn)?shù)(volume fraction)增加，支架孔壁厚度(trabecularthi

6、ckness，Tb.Th)和支架孔隙間隙(trabecular separation)增加，但支架表面積/體積比(bone surface/volume ratio，BS/BV)減少，總的孔隙率(total porosity)降低。
　　 2.參照生理載荷范圍，根據(jù)有限元計(jì)算的支架材料內(nèi)部應(yīng)變分布，確定實(shí)驗(yàn)表觀加載應(yīng)變?yōu)?με、1200με、2800με、7000με。施加1200με表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％在1000με

7、-2000με之間，但主要集中在1000με；施加2800με表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％在1000με-2000με之間，但主要集中在2000με；施加7000με表觀加載應(yīng)變時(shí)，內(nèi)部應(yīng)變60％大于5000με。四組樣品在支架孔壁處存在應(yīng)力集中現(xiàn)象。
　　 3.細(xì)胞增殖曲線(xiàn)說(shuō)明7000με的壓縮應(yīng)變抑制細(xì)胞增殖。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，在1200με、2800με的壓縮應(yīng)變作用下，細(xì)胞增殖速度快，數(shù)量增多。
　　 4.RT-

8、PCR以及Western Blot結(jié)果顯示，與靜態(tài)培養(yǎng)組相比，1200με、2800με壓縮應(yīng)變促進(jìn)了成骨分化特異基因BMP-2、Runx2、ALP、ColⅠ及OCN的表達(dá)，2800με壓縮應(yīng)變條件下表達(dá)最強(qiáng)，而7000με壓縮應(yīng)變抑制其表達(dá)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1.六種材料中3 wt％HA材料組具有理想的孔隙結(jié)構(gòu)(>100μm)。MC3T3-E1成骨前體細(xì)胞易在CS/HA/DBM三維支架材料上黏附、增殖，表明該支

9、架材料具有良好的生物相容性。根據(jù)材料結(jié)構(gòu)參數(shù)、力學(xué)特性及細(xì)胞相容性結(jié)果確定質(zhì)量比3:3:1.5組的支架材料作為后期實(shí)驗(yàn)材料。根據(jù)細(xì)胞增殖曲線(xiàn)確定壓縮應(yīng)變時(shí)間為6d。
　　 2.壓縮應(yīng)變可促進(jìn)成骨，為研究力學(xué)作用增加骨強(qiáng)度提供了一個(gè)分子模型。合適的力學(xué)刺激作用下細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)表明力學(xué)刺激在促進(jìn)骨折愈合中的重要性。研究結(jié)果還表明超生理力學(xué)刺激抑制細(xì)胞的增殖。
　　 3.通過(guò)有限元分析方法得到了支架材料局部各處的應(yīng)變分布，計(jì)