豬鏈球菌粘附素蛋白Fhb與受體Gb2復合物晶體結構解析.pdf

1、豬鏈球菌是一種新發(fā)的人獸共患病病原，可以引起豬腦膜炎、膿毒癥，也能引起人腦膜炎和中毒休克樣綜合征。豬鏈球菌是引起成人鏈球菌腦膜炎的第二大病因，僅次于肺炎鏈球菌。在已鑒定的35種血清型中，豬鏈球菌血清2型是最主要的致病菌株。但是，豬鏈球菌血清2型引起腦膜炎的分子機理還不清楚。
　　細菌粘附素分子和宿主細胞表面受體介導的細菌粘附在豬鏈球菌腦膜炎中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明豬鏈球菌粘附素Fhb可以與宿主細胞表面的糖脂分子GbO3結合。我們

2、課題組發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)hb是引起豬鏈球菌腦膜炎的重要毒力因子。Fhb能激活TGF-β信號通路，下調(diào)claudin-5的表達，增強血腦屏障的通透性，促使豬鏈球菌穿過血腦屏障。我們實驗室證實GbO3參與Fhb介導的豬鏈球菌與人腦微血管內(nèi)皮細胞粘附和穿血腦屏障過程。但是Fhb如何特異性的識別受體GbO3的結構機理尚不清楚。
　　此外，F(xiàn)hb在豬鏈球菌血中存活和逃避補體介導的宿主天然免疫中發(fā)揮著重要作用。Fhb通過招募人補體調(diào)節(jié)因子factor

3、H，協(xié)助factor I降解沉積在豬鏈球菌表面的補體成分C3b，從而抑制補體介導的調(diào)理吞噬作用。Fhb還能與補體成分C3b和C3d直接結合。但是，F(xiàn)hb結合多種血清成分的結構基礎還不清楚。本研究運用結構生物學手段解析了Fhb以及Fhb與受體Gb2復合物的結構，解釋了Fhb識別受體Gb3的結構機理，并發(fā)現(xiàn)了Fhb與多種血清成分結合的結構基礎。
　　本文第一部分是Fhb蛋白的表達純化以及結晶篩選和優(yōu)化。生物信息學分析表明Fhb由二級結

4、構豐富的N端和無規(guī)卷曲組成的C端組成。先前的研究表明Fhb與受體相互作用的區(qū)域為N端。因此，我們表達了45-344aa的片段N-Fhb，并利用Ni2+柱和分子篩純化了N-Fhb，然后利用晶體篩選工具盒進行了結晶篩選和優(yōu)化，獲得了一套分辨率2.33的數(shù)據(jù)。純化和結晶的過程中，我們發(fā)現(xiàn)N-Fhb存在降解。蛋白印跡和蛋白N端測序顯示N-Fhb降解的位點是K139。因此，我們又表達了Fhb從139-343aa的片段Fhb RBD，然后進行了純化

5、、結晶篩選和優(yōu)化，獲得一套分辨率1.65的衍射數(shù)據(jù)。由于Fhb RBD沒有同源結構，無法通過MR法來解析結構。我們利用大腸桿菌B834菌株表達了Fhb RBD硒代蛋白，然后純化和結晶硒帶蛋白，最終收集到了一套分辨率1.5的衍射數(shù)據(jù)。
　　本文第二部分是 Fhb和Fhb與 Gb2復合物的結構解析。利用 SAD法解析N-Fhb結構時，發(fā)現(xiàn)反常散射信號太弱，無法解析結構。通過用B834菌株表達Fhb RBD，提高Se原子替代率，增強反常

6、散射信號和提高信噪比，最終采用SAD法解析了Fhb RBD的結構。以Fhb RBD的結構為模型，采用 MR法解析了Fhb RBD與Gb2復合物的結構。
　　本文第三部分分析了Fhb RBD和Fhb RBD與Gb2復合物的結構，闡明Fhb識別Gb2的結構機理，解釋 Fhb招募多種血清成分的結構基礎。Fhb RBD是由一個典型的β三明治核心和外側的3個α螺旋組成。受體Gb2結合在Fhb表面一個凹陷的口袋中。Fhb與Gb2結合主要由氫鍵

7、和疏水作用介導。對于α-Gal， Y198與6-OH形成氫鍵，Q255與6-OH和O-5形成氫鍵，R238與4-OH，N285和G233與3-OH形成氫鍵。對于β-Gal，K316與2-OH和3-OH形成氫鍵，E327與2-OH形成氫鍵。Y198，F(xiàn)283，F(xiàn)318與α-Gal的非極性面形成疏水接觸作用， W258與β-Gal的非極性面形成疏水作用。ITC測定了與受體結合相關氨基酸突變體與Gb2的親和力，突變體蛋白與Gb2的結合能力顯著

8、下降。Fhb的天然受體是Gb3和Gb4，但Fhb對兩者結合能力差別很大。通過結構模擬，我們解釋了Fhb對Gb3和Gb4結合能力的差異。氨基酸組成分析表明N-Fhb富含帶電的氨基酸，尤其是帶負電的氨基酸。表面電荷分布分析也表明，F(xiàn)hb RBD表面有大片的負電荷集中區(qū)和正電荷集中區(qū)。不同factor H結合蛋白序列和結構同源度都很低。但是已解析結構的3個factor H結合蛋白表面都有比較大面積的負電荷集中區(qū)，而且已被證實主要通過表面帶負電

9、的氨基酸與factor H結合。我們推測Fhb也是通過表面負電荷集中區(qū)與factor H結合。目前已經(jīng)解析結構的多種金黃色葡萄球菌C3d結合蛋白表面都有大面積的正電荷集中區(qū)，而C3d表面有大面積的負電荷集中區(qū)，兩者通過電荷互作結合。我們推測 Fhb也通過電荷互作與C3d結合。C3d是C3b的一個降解片段，F(xiàn)hb應該通過電荷互作與C3b結合。
　　本文第四部分解析了另外一個功能未知的豬鏈球菌毒力因子1083蛋白的結構。通過序列和結構