TNF-α增強(qiáng)肝腎綜合征腎血管收縮機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　肝腎綜合征(HRS)的病理生理標(biāo)志是腎血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致腎皮質(zhì)血流量減少，腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)下降。GFR的大小決定于有效濾過(guò)壓和濾過(guò)系數(shù)，而腎血管收縮是引起有效濾過(guò)壓降低的決定因素。腎入球動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)的功能狀態(tài)直接影響腎入球小動(dòng)脈的舒縮，胞漿游離Ca2+濃度([Ca2+]i)升高與RASMCs收縮密切相關(guān)，由于RASMCs對(duì)許多縮血管活性物質(zhì)（如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素、血栓素A2、內(nèi)皮

2、素、白三烯等）均敏感，當(dāng)接受這些物質(zhì)刺激時(shí)，[Ca2+]i會(huì)明顯升高，引起細(xì)胞收縮。1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2+釋放通道，因此RASMCs中IP3R表達(dá)量的多少影響其對(duì)縮血管物質(zhì)的敏感性。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與重癥感染時(shí)腎衰的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HRS發(fā)生時(shí)血中TNF-α水平也明顯升高，有文獻(xiàn)指出TNF-α可間接參與平滑肌細(xì)胞的收縮。TNF-α可否影響IP3R表達(dá)進(jìn)而參與RASMCs收縮引起的腎血

3、流減少尚不清楚。本研究應(yīng)用離體灌注腎技術(shù)(IPKT)從器官水平觀察TNF-α預(yù)灌流后離體大鼠腎血管對(duì)ET收縮反應(yīng)性的改變;應(yīng)用原代培養(yǎng)的RASMCs，從細(xì)胞水平觀察TNF-α對(duì)[Ca2+]i及細(xì)胞收縮程度的影響;并從分子水平探討其可能機(jī)制，即TNF-α對(duì)RASMCs內(nèi)Ⅰ型IP3R蛋白、mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子活性的影響，揭示TNF-α在HRS發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　1、離體灌注腎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?br>　　應(yīng)用戊巴比

4、妥鈉(30 mg/Kg體重)經(jīng)腹腔注射將大鼠麻醉。剪毛，腹壁消毒，正中切開(kāi)，分離腸系膜上動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈、右腎靜脈及右側(cè)輸尿管。用套管針從腸系膜上動(dòng)脈插管，經(jīng)腹主動(dòng)脈，插入右腎動(dòng)脈起始部，管外接三通，三通接張力換能器和灌注裝置，腎靜脈開(kāi)放，在腸系膜上動(dòng)脈及右腎動(dòng)脈主干分別結(jié)扎。左腎取出稱重作為對(duì)照腎重。灌注過(guò)程:在腹主動(dòng)脈插管至腎動(dòng)脈時(shí)啟動(dòng)灌注泵，開(kāi)始灌流。灌注液流量恒定為5 ml/min，經(jīng)熱交換器加溫至37℃，經(jīng)氧合器持續(xù)給95％氧和

5、5％二氧化碳的混合氣，灌注液為一次性，不再循環(huán)應(yīng)用。
　　2、觀察TNF-α對(duì)ET收縮腎血管強(qiáng)度的影響
　　28只SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=7)，應(yīng)用離體灌注腎技術(shù)(IPKT)灌流離體大鼠腎臟，并測(cè)定腎血管灌注壓。
　　分組:A1組無(wú)鈣Kreb's液預(yù)灌流+ET刺激;
　　A2組(TNF-α+無(wú)鈣Kreb's液)預(yù)灌流+ET刺激;
　　B1組(無(wú)鈣Kreb's液+2-APB)預(yù)灌流+ET刺激;
　　B

6、2組(TNF-α+無(wú)鈣Kreb's液+2-APB)預(yù)灌流+ET刺激。
　　3、原代大鼠RASMCs分離與培養(yǎng)
　　麻醉大鼠，開(kāi)腹，于左腎動(dòng)脈穿刺插管，用含6％BSA的冷PSS灌注至腎臟變白，留取皮質(zhì)，經(jīng)180μM的篩網(wǎng)擠壓過(guò)濾，將篩網(wǎng)上存留的血管組織經(jīng)酶消化20min，經(jīng)70μm的篩網(wǎng)過(guò)濾，再次經(jīng)酶消化15min，原代分離大鼠RASMCs，于20％FCS的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合后常

7、規(guī)傳代。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，經(jīng)間接免疫熒光抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白抗體、抗平滑肌肌球蛋白重鏈單克隆抗體染色陽(yáng)性、透射電鏡觀察到微絲鑒定為RASMCs。取3-10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　4、觀察TNF-α對(duì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響
　　應(yīng)用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記技術(shù)及confocol共聚焦顯微鏡檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i動(dòng)態(tài)變化。分組:TNF-α處理0h+ET刺激組和TNF-α處理24h+ET刺激組;2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-

8、APB)+ ET刺激組和TNF-α+2-APB+ET刺激組。
　　5、觀察TNF-α對(duì)RASMCs收縮敏感性的影響
　　通過(guò)測(cè)量RASMCs收縮前、后的表面積得出細(xì)胞收縮的幅度。分組同測(cè)鈣組。
　　6、檢測(cè)TNF-α對(duì)RASMCsⅠ型IP3R蛋白及mRNA表達(dá)的影響
　　應(yīng)用Western blot、Real-time quantitative PCR方法，檢測(cè)TNF-α處理后 RASMCs內(nèi)Ⅰ型IP3R蛋白及m

9、RNA的表達(dá)。分組:TNF-α處理0h、4h、8h、24h組;
　　7、TNF-α對(duì)Ⅰ型IP3R啟動(dòng)子活性的影響
　　將重組質(zhì)粒PGL3-IP3RI promoter轉(zhuǎn)染RASMCs，通過(guò)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(luc)報(bào)告基因的表達(dá)活性，說(shuō)明TNF-α對(duì)Ⅰ型IP3R啟動(dòng)子活性的影響。分組:TNF-α處理0h、4h、8h、24h組。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠離體腎體外灌注結(jié)果
　　平衡期過(guò)后，當(dāng)分別將TNF-α

10、、2-APB加入灌注液中進(jìn)行預(yù)灌流時(shí)，灌注壓仍保持在基礎(chǔ)灌注壓水平，無(wú)明顯改變。A1及A2組ET刺激后腎灌注壓較基礎(chǔ)灌注壓明顯升高(t=2.779，P=0.016;t=5.689，P=0.000)，且A2組灌注壓增高值與A1組相比具有顯著性差異(t=3.319，P=0.006);B1及B2組ET刺激后腎灌注壓無(wú)明顯改變。
　　2、RASMCs內(nèi)[Ca2+]i測(cè)量結(jié)果
　　Fluo-3/AM標(biāo)記后顯示，內(nèi)皮素(ET)刺激可使R

11、ASMCs胞內(nèi)[Ca2+]i在短時(shí)間內(nèi)迅速、顯著的增加。TNF-α處理24h后上述效應(yīng)明顯增強(qiáng)，[Ca2+]i上升幅度與0h組相比有顯著性差異(t=5.335，P=0.000)。且上述效應(yīng)可被2-APB完全阻斷。
　　3、RASMCs表面積測(cè)量結(jié)果
　　TNF-α處理0h組加入ET約1min時(shí)，即出現(xiàn)可見(jiàn)的細(xì)胞收縮變化;3min時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，細(xì)胞面積明顯縮小。TNF-α處理24h后上述效應(yīng)明顯增強(qiáng)，細(xì)胞面積縮小的更

12、加明顯，與前者相比差異顯著(t=6.641，P=0.000)。
　　4、Western blot半定量分析RASMCsⅠ型IP3R蛋白的表達(dá)
　　0h組RASMCs內(nèi)Ⅰ型IP3R表達(dá)水平較低，TNF-α處理4h～24h組Ⅰ型IP3R蛋白的表達(dá)明顯增高，以24h最為明顯，與0h組比較均有顯著差異(4h: P=0.039;8h: P=0.01;24h: P=0.003)。
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RASMCsⅠ型IP3R

13、 mRNA表達(dá)
　　TNF-α處理4h～24h組RASMCs內(nèi)Ⅰ型IP3R mRNA的表達(dá)明顯增高，以TNF-α處理8h時(shí)最為明顯，與0h組比較差異顯著(4h: P0.049;8h: P=0.002;24h:P=0.011)。
　　6、RASMCs內(nèi)Ⅰ型IP3R啟動(dòng)子活性檢測(cè)
　　在0h組RASMCs內(nèi)，Ⅰ型IP3R啟動(dòng)子活性很弱;TNF-α處理4h～24h組，Ⅰ型IP3R啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，以TNF-α處理8h最為明顯，