達(dá)肝素鈉對肺腺癌A549細(xì)胞體外生長狀態(tài)的影響及機制探討.pdf

1、研究背景與目的： 未分級肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)通過激活生理性的凝血抑制劑抗凝血酶在抗凝血方面發(fā)揮重要作用?？鼓改軌虻窒麉⑴c凝血的許多絲氨酸蛋白酶尤其是凝血因子X和凝血酶的作用。 除了抗凝作用外，UFH和LMWH還具有廣泛的其他生物學(xué)活性。UFH和LMWH在腫瘤治療方面的積極作用已被證實。MALT(malignancy and low-molecular-weight heparin therapy)

2、是在沒有合併靜脈血栓的進(jìn)展期腫瘤患者上進(jìn)行的關(guān)于肝素的臨床試驗，該試驗的結(jié)果表明使用LMWH可以延長患者的生存期。FAMOUS(The fragmin advanced malignancy outcome study)的研究結(jié)果與MALT基本一致。另外，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，LMWH能夠增強化療藥物的抗腫瘤作用。大量的資料表明，肝素及其衍生物在腫瘤治療上表現(xiàn)出的良好作用不只與其抗凝作用有關(guān)。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的UFH和LMWH影響腫瘤生長

3、和轉(zhuǎn)移的可能機制包括：1。UFH和LMWH影響腫瘤血管形成；2.UFH和LMWH影響選擇素與選擇素配體的結(jié)合；3.UFH和LMWH影響機體免疫；4.UFH和LMWH能抑制降解基底膜的肝素酶的活性；5.UFH和LMWH能調(diào)節(jié)多種肝素結(jié)合生長因子和整合素的功能。 UFH和LMWH對一些細(xì)胞的生長有直接的抑制作用。不論在體內(nèi)還是在體外，UFH和LMWH都能降低血管平滑肌細(xì)胞的有絲分裂活動。氣道和腸道的平滑肌細(xì)胞以及腎實質(zhì)細(xì)胞對UFH和

4、LMWH也有同樣的反應(yīng)。UFH還能夠誘導(dǎo)來自于急性淋巴母細(xì)胞性白血病患者的淋巴母細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞凋亡。然而，在肺腺癌細(xì)胞上進(jìn)行的有關(guān)UFH和LMWH研究卻很少，目前還不明確UFH和LMWH是否對A549肺腺癌細(xì)胞有直接的生長和增殖抑制作用。 細(xì)胞和組織的穩(wěn)定狀態(tài)嚴(yán)格依賴于信號途徑網(wǎng)的協(xié)調(diào)性調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)使得細(xì)胞和組織在增殖與生長阻滯、分化與靜止、生存與凋亡之間保持動態(tài)的平衡。任何方面的過分的調(diào)節(jié)都可能導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)

5、展。一些細(xì)胞生長的負(fù)性調(diào)節(jié)因子的失活或活性下降與腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展有關(guān)，也在一定程度上導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的高侵襲性和高增殖性。細(xì)胞周期的進(jìn)展受許多因子的控制，這些因子主要包括周期素(cyclin)、周期素依賴性激酶(cyclin-dependent-kinase，CDK)和周期素依賴性激酶的抑制劑(CDK-inhibitor，CDKI)CDKI是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能抑制CDK-cyclin復(fù)合體的活性，將細(xì)胞抑制在某個時期。目前發(fā)現(xiàn)的CD

6、KI有兩個家族，KIP家族和INK4家族。KIP家族包括p21WAF1、p27KIP1和p57KIP2三個成員；INK4家族包括p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c和p19INK4d四個成員。KIP家族能結(jié)合大多數(shù)的與G1/S轉(zhuǎn)變有關(guān)的CDK-Cyclin復(fù)合體并抑制其活性。INK4家族特異性與CDK4和CDK6結(jié)合而抑制其活性。 在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中有一個限制點(restriction point，R)和兩個控制點

7、(checkpoint)對正常細(xì)胞周期的運行具有重要的調(diào)控作用。R點位于G1時相的中間區(qū)。兩個控制點一個是G1/S控制點，控制G1期進(jìn)入S期，另一個是G2/M控制點，控制G2期進(jìn)入M期。G1/S控制點是細(xì)胞增殖過程中主要的一個控制點，受p21WAF1多層次的調(diào)節(jié)。在沒有生長因子和其他有絲分裂原刺激的情況下，細(xì)胞完成有絲分裂后將停滯在G0期，G0期是G1期的早期的可逆階段。處于G0期的細(xì)胞在持續(xù)的有絲分裂原刺激下產(chǎn)生cyclinD，cyc

8、linD與CDK4或CDK6形成CDK4/CDK6-cyclin D復(fù)合體，經(jīng)磷酸化修飾呈絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，在G1中期達(dá)到高峰，促使細(xì)胞越過R點進(jìn)入G1后期。在G1晚期還出現(xiàn)CDK2/cyclin E復(fù)合體蛋白激酶。由CDK2/cyclin E復(fù)合體和CDK4/CDK6-cyclin D復(fù)合體這兩種激酶磷酸化pRb，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)與DNA復(fù)制有關(guān)的基因表達(dá)，為DNA復(fù)制準(zhǔn)備條件。CDK2/cyclin E復(fù)合體蛋白激酶在

9、G1晚期達(dá)到高峰，促使細(xì)胞越過G1/S控制點而進(jìn)入S期。細(xì)胞在越過G1/S控制點進(jìn)入S期后，細(xì)胞的分裂不再需要有絲分裂原的刺激，主要由CDK2/cyclin A復(fù)合體參與DNA復(fù)制的進(jìn)行。在G2期，CDK1先后與cyclin A和B結(jié)合形成CDK1-cyclin A和CDK1-cyclin B復(fù)合體，但由于cyclin A在經(jīng)過S期后含量降低，故在G2期內(nèi)主要由CDK1-cyclin B復(fù)合體呈現(xiàn)功能，促使細(xì)胞越過G2/S控制點。

10、 p21WAF1和p27KIP1在腫瘤的形成和發(fā)展中都起了重要作用。在許多腫瘤，包括肺癌，p21WAF1和p27KIP1的表達(dá)降低。降低了的p21WAF1和p27KIP1表達(dá)造成細(xì)胞生長與死亡的平衡失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展。一些藥物通過提高p21WAF1和p27KIP1表達(dá)水平來抑制腫瘤生長。目前還不明確UFH或LMWH是否能通過p21WAF1和p27KIP1對A549細(xì)胞發(fā)揮其抑制生長的作用。 材料和方法： 在此項

11、研究中，我們用達(dá)肝素鈉干預(yù)體外培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞系，觀察某些與細(xì)胞生物學(xué)特性有關(guān)的指標(biāo)的變化。 首先，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，用五種不同濃度(0IU/mL，，2IU/mL，10IU/mL，50IU/mL，100IU/mL和500IU/mL)的達(dá)肝素鈉干預(yù)A549細(xì)胞的生長，用MTT方法在四個時間點(6h，12h，24h和36h)檢測細(xì)胞活性，并確定用于隨后研究的最佳藥物濃度。 為觀察達(dá)肝素鈉對A549細(xì)胞周期進(jìn)展的影響，將經(jīng)

12、過24h普通培養(yǎng)的A549細(xì)胞繼續(xù)在含有50IU/mL達(dá)肝素鈉的培養(yǎng)液中培育，以正常培育的細(xì)胞作為對照組，將兩組細(xì)胞24h后以PI染液染色，用流式細(xì)胞儀檢測并分析細(xì)胞周期的分布。 為了解達(dá)肝素鈉對A549細(xì)胞凋亡狀態(tài)的影響，用上述方法培育細(xì)胞，24h后收集各組細(xì)胞，以AnnexinV-FITC和PI雙染所收集的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞的比率并分析數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)與對照組比較。 為明確達(dá)肝素鈉是否通過p21WAF1和p

13、27KIP1這兩種重要的細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用，我們通過western blotting法和RT-PCR法分別檢測了p21WAF1和p27KIP1蛋白和mRNA的水平，以各組的內(nèi)參作組內(nèi)平衡，以正常培育的A549細(xì)胞為對照組。 為進(jìn)一步闡明p21WAF1和p27KIP1在達(dá)肝素鈉對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期抑制中的作用，我們首先用特異性的siRNA分別沉默p21WAF1和p27KIP1基因的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染隨機序列si

14、RNA的細(xì)胞為對照組，并以western blotting法證實各自的沉默效果，在24h后按前述方法檢測細(xì)胞周期的分布和凋亡分布情況。 數(shù)據(jù)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行t-檢驗或ANOVA分析，顯著性檢驗水平為P＜0.01或0.05。 結(jié)果： 1.達(dá)肝素鈉降低A549細(xì)胞活性，而且這種作用表現(xiàn)出時間依賴性和濃度依賴性。50IU/mL達(dá)肝素鈉在干預(yù)細(xì)胞生長24h后能抑制大約50％的細(xì)胞活性。 2.流式細(xì)胞分析顯示達(dá)

15、肝素鈉抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。與對照組相比，試驗組細(xì)胞在G1期比率顯著增加(P＜0.05)，在S期比率明顯降低(P＜0.05)。處于G2/M期的細(xì)胞比率雖有增加，但這種差異與對照組比沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 3.與對照組相比，50IU/mL達(dá)肝素鈉培育的A549細(xì)胞早期凋亡比率高于對照組(P＜0.05)。另外，達(dá)肝素鈉不增加死亡細(xì)胞的比率。 4.達(dá)肝素鈉提高p21WAF1和p27KIP1蛋白的水平，但對p21WAF1

16、和p27KIP1mRNA水平?jīng)]有明顯影響。 5.用靶向性的siRNA沉默p21WAF1基因后達(dá)肝素鈉對A549細(xì)胞的周期抑制和凋亡誘導(dǎo)作用明顯減弱(P＜0.05)；對p27KIP1基因沉默后得到類似的結(jié)果。 結(jié)論：和意義： 1.達(dá)肝素鈉能降低A549細(xì)胞活性。 2.A549細(xì)胞活性的降低是由達(dá)肝素鈉對細(xì)胞周期的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用導(dǎo)致的。 3.A549細(xì)胞表達(dá)低到中等水平的p21WAF1和p27K

17、IP1蛋白。 4.p21WAF1和p27KIP1蛋白至少部分參與了達(dá)肝素鈉的對A549細(xì)胞周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)過程。 5.達(dá)肝素鈉引起的A549細(xì)胞p21WAF1和p27KIP1蛋白的改變發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。 6.發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的p21WAF1和p27KIP1蛋白的改變最終導(dǎo)致了A549細(xì)胞在細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡狀態(tài)和細(xì)胞活性方面的變化。 7.該課題的研究結(jié)果從另外一個角度解釋了低分子肝素的抗腫瘤作用機理，為