構(gòu)建人CXCL12-KDEL融合基因“胞內(nèi)捕獲”CXCR4抑制口腔鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)： 第一部分CXCL12-CXCR4在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 目的：觀察趨化因子CXCL12及其受體CXCR4在頭頸部鱗癌(headandnecksquamouscarcinoma，HNSCC)組織及頸部淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，分析CXCL12、CXCR4的表達(dá)與頭頸鱗癌臨床、病理的關(guān)系，探討CXCL12-CXCR4生物軸在頭頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用。 方法：總結(jié)2005-2

2、006年于天津腫瘤醫(yī)院頭頸科手術(shù)切除及活檢的65例具有完整臨床病理資料的頭頸部鱗癌標(biāo)本特點(diǎn)，以正常口腔黏膜組織及良性腫瘤15例作為對(duì)照，用免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR方法檢測(cè)CXCL12、CXCR4在各組中的表達(dá)情況，觀察不同組別CXCL12、CXCR4的表達(dá)區(qū)別及其與HNSCC臨床生物學(xué)行為--主要是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移--的關(guān)系。 結(jié)果：頭頸鱗癌患者CXCR4免疫組化陽(yáng)性率：I-II期為26.9％(7/26)，III-IV期為71.

3、8％(28/39)，差異有顯著性(P<0.01)；鱗癌高、中分化者陽(yáng)性率為42.6％(20/47)，低分化為83.3％(15/18)，差別有顯著性差異(P<0.01)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率71.4％(25/35)，無(wú)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率為33.3％(10/30)，正常對(duì)照組表達(dá)極低，差別有顯著性差異(P<0.05)。原發(fā)灶CXCL12的陽(yáng)性率在所有臨床、病理參數(shù)分組的表達(dá)高低均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，在良性及正常組織對(duì)照中為低表達(dá)。

4、 RT-PCR結(jié)果：發(fā)生轉(zhuǎn)移組中CXCR4表達(dá)明顯高于非轉(zhuǎn)移組及對(duì)照組(P<0.05)；而未轉(zhuǎn)移組CXCR4表達(dá)高于良性對(duì)照組表達(dá)(P<0.05)。有轉(zhuǎn)移瘤組織的淋巴結(jié)CXCR4的表達(dá)明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移組織的淋巴結(jié)(P<0.05)，而兩組淋巴結(jié)中CXCL12的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：趨化因子CXCL12在轉(zhuǎn)移靶器官(淋巴結(jié))的表達(dá)明顯高于非靶器官(脂肪)的表達(dá)；趨化因子受體CXCR4的高表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生淋

5、巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。CXCR4表達(dá)高低可能會(huì)影響CXCL12的趨化作用，驗(yàn)證了CXCL12-CXCR4生物軸能夠促進(jìn)HNSCC向頸淋巴結(jié)的定向轉(zhuǎn)移。 第二部分CXOL12-KDEL融合基因的構(gòu)建與鑒定及其“胞內(nèi)捕獲”CXCR4抗CXCL12-CXCR4趨化口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究 目的：構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL及趨化因子CXCL12的融合基因CXCL12-KDEL(帶有E-tag標(biāo)簽)，克隆入pIRES2-EGF

6、P真核表達(dá)載體。融合基因CXCL12-KDEL轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tb3.1，抑制CXCR4在細(xì)胞膜表達(dá)，從而阻斷CXCL12-CXCR4生物軸，觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞的趨化作用的影響。 方法：在GenBank檢索人CXCL12基因編碼序列，確定擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)引物并加入KDEL序列。取口腔鱗癌的頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，以Trizol提取總RNA，使用RT-PCR方法獲得CXCL12-KDEL融合基因的編碼序列，克隆入pMD19-T載

7、體。測(cè)序鑒定后亞克隆至plRES2-EGFP真核表達(dá)載體中，并再次測(cè)序驗(yàn)證。使用脂質(zhì)體將CXCL12-KDEL真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至高轉(zhuǎn)移人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tb3.1，觀察轉(zhuǎn)染效率(實(shí)驗(yàn)組)。同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-EGFP組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組作為對(duì)照組，進(jìn)行以下功能試驗(yàn)：Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染融合基因后的癌細(xì)胞中帶有E-tag標(biāo)簽的CXCL12的蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞膜CXCR4蛋白表達(dá)；Chemotaxis

8、chamber細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后鱗癌細(xì)胞對(duì)CXCL12的趨化、遷移能力。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異。 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序證實(shí)，正確構(gòu)建了人CXCL12-KDEL融合基因，并克隆入真核載體pIRES2-EGFP，獲得CXCL12-KDEL-pIRES2-EGFP重組載體。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CXCL12-KDEL-pIRES2-EGFP至鱗癌細(xì)胞系Tb3.1，72h效率最高，達(dá)50％以上。Westernblot檢測(cè)證實(shí)實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染細(xì)胞有E-tag

9、標(biāo)記的CXCL12蛋白表達(dá)，而兩對(duì)照組及三種細(xì)胞上清中均無(wú)E-tag標(biāo)記的CXCL12蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜CXCR4表達(dá)明顯較對(duì)照組降低。轉(zhuǎn)染CXCL12-KDEL組、pIRES2-EGFP組及未轉(zhuǎn)染組受CXCL12趨化遷移的鱗癌細(xì)胞數(shù)分別為216.00±84.12，711.33±49.54，825.67±62.80，轉(zhuǎn)染CXCL12-KDEL細(xì)胞趨化較兩對(duì)照組明顯減少。 結(jié)論：成功構(gòu)建了表達(dá)CXCL12-KDEL融合基