陰道毛滴蟲金免疫層析檢測(cè)技術(shù)的建立及重組蛋白AP33的免疫保護(hù)機(jī)制初探.pdf

1、陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis，T.V)是一種寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛蟲，可引起滴蟲性陰道炎等多種生殖系統(tǒng)疾病。目前國內(nèi)外臨床常規(guī)檢查方法是生理鹽水涂片法，但其敏感性受多種因素的影響。因此有必要建立一種簡便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的滴蟲病診斷方法。我們利用雜交瘤技術(shù)，篩選出4A2、4F11、4F8、4E7和4H115株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，通過不同株單抗配對(duì)，優(yōu)化最佳反應(yīng)模式，初步建立了檢測(cè)AP33抗原的

2、膠體金免疫層析法。 臨床常用甲硝唑治療陰道毛滴蟲感染，但存在誘導(dǎo)耐藥蟲株的產(chǎn)生和致畸等嚴(yán)重問題。關(guān)于陰道毛滴蟲的致病機(jī)制，目前研究較多的是有關(guān)蟲體黏附宿主上皮細(xì)胞過程。Arroyo和Engbring已證明陰道毛滴蟲主要通過四種表面黏附蛋白(AP65、AP51、AP33、AP23)黏附于泌尿生殖道上皮細(xì)胞，其中ap33基因保守，分子量小。因此以重組蛋白AP33為靶點(diǎn)研制陰道毛滴蟲預(yù)防或治療性多價(jià)疫苗將具有十分重要的意義。

3、研究目的： 用膠體金標(biāo)記抗陰道毛滴蟲重組AP33單克隆抗體制備金標(biāo)AP33McAb，研制開發(fā)出一種能快速、簡便、有效檢測(cè)陰道毛滴蟲感染的免疫層析(GICA)試紙條。探討陰道毛滴蟲重組AP33融合蛋白對(duì)宿主的保護(hù)性免疫機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、金標(biāo)AP33單克隆抗體制備 用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，并用透射電鏡和紫外分光光度計(jì)鑒定其大小和均勻度。根據(jù)光電比色法確定膠體金標(biāo)記單抗的最適穩(wěn)定量，標(biāo)記抗陰道毛

4、滴蟲重組AP33單克隆抗體。 二、檢測(cè)試紙條的組裝及測(cè)試 1.選擇任一株單抗點(diǎn)膜，然后分別與其他4株單抗配伍(金標(biāo))，選擇反應(yīng)最強(qiáng)的配伍對(duì)組裝試紙條。 2.取待檢標(biāo)本15-30μl滴入試紙條加樣孔，標(biāo)本通過層析運(yùn)動(dòng)到NC膜上，與包被單抗發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)紅色可見條帶，全部實(shí)驗(yàn)過程需要3-15min。 3.對(duì)本試紙條進(jìn)行一系列性能測(cè)試，包括靈敏度測(cè)定、特異性測(cè)定、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本檢測(cè)。

5、三、重組AP33蛋白的免疫保護(hù)性研究 1.重組AP33蛋白的表達(dá)、純化與鑒定 2.重組AP33蛋白免疫BALB/c小鼠 3.免疫指標(biāo)檢測(cè)及動(dòng)物攻擊實(shí)驗(yàn) 3.1免疫血清中IgA、IgG效價(jià)的測(cè)定 3.2免疫后小鼠脾細(xì)胞CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群測(cè)定 3.3脾細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子含量的測(cè)定：mIL-2、mIFN-γ、mIL-4、mIL-6等 3.4動(dòng)物攻擊實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別用培

6、養(yǎng)3代以上的滴蟲分別進(jìn)行皮下和腹腔攻擊，觀察小鼠形態(tài)、行為變化及死亡時(shí)間 結(jié)果： 1.金標(biāo)AP33單克隆抗體的制備 透射電鏡下觀察，本研究制備的膠體金顆粒均勻，紫外分光光度計(jì)400-600nm掃描結(jié)果最大吸收波長為524mn,峰寬較窄。采用光電比色法，確定膠體金標(biāo)記蛋白的最適穩(wěn)定量為36μg/ml。 2.檢測(cè)試紙條的組裝及測(cè)試 用制備的免疫層析試紙條檢測(cè)重組AP33抗原的最低量為20ng/ml，其

7、中以單克隆抗體4A2為包被抗體、單克隆抗體4F8為金標(biāo)抗體的試紙條檢測(cè)效果最佳。以濕片法為標(biāo)準(zhǔn)，用該試紙條檢測(cè)60例滴蟲性陰道炎患者白帶，敏感性為90.0％(54/60)；檢測(cè)60例非滴蟲性陰道炎患者白帶，特異性為95.0％(57/60)。兩法的總符合率為92.5％。 3.重組AP33蛋白的免疫保護(hù)機(jī)制研究 3.1Western-blotting顯示該蛋白可被鼠抗陰道毛滴蟲全蟲抗原血清所識(shí)別。間接ELISA法表明重組蛋白

8、AP33免疫小鼠后的血清可與該重組蛋白及陰道毛滴蟲全蟲抗原發(fā)生反應(yīng)。 3.2經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞中CD4+淋巴細(xì)胞有所增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而CD8+淋巴細(xì)胞無明顯變化，CD4+/CD8+比值明顯增加(P＜0.01)。培養(yǎng)72h后實(shí)驗(yàn)組脾細(xì)胞上清中4種細(xì)胞因子含量均顯著高于對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中mIFN-γ濃度增高最明顯為(453.15±60.78)pg/

9、mL(P＜0.01)。間接ELISA法測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠血清IgA效價(jià)為1:12800，IgG效價(jià)為1:51200。皮下注射組，實(shí)驗(yàn)組小鼠背部出現(xiàn)明顯潰瘍；腹腔注射組，小鼠出現(xiàn)豎毛、倦怠、活動(dòng)減少、腹部塌陷、飲水及采食減少等異常變化，對(duì)照組小鼠6d內(nèi)全部死亡，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活時(shí)間比對(duì)照組長，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功建立了以AP33為靶蛋白檢測(cè)陰道毛滴蟲感染的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)(GICA)，制