陰道毛滴蟲(chóng)鐵氧還蛋白基因的克隆與表達(dá).pdf

1、四川大學(xué)碩士學(xué)位論文陰道毛滴蟲(chóng)鐵氧還蛋白基因的克隆與表達(dá)姓名：謝輝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：王雅靜20050420叫川大學(xué)碩士學(xué)位論文Chelex—100方法提取基因組DNA，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成引物，用PCR法擴(kuò)增Fd基因，克隆kpⅦ)18T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌JMl09感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR及限制性酶切鑒定，測(cè)序并進(jìn)行序列分析，分析該基因四『lf分離株和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株之闖的差異。結(jié)果：我們成功地從四川分離株中擴(kuò)增和克隆出

2、長(zhǎng)度為306bp的Fd基因，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)抹比較，同緣性為99％，這方面存瑩工作為鼗國(guó)滴蟲(chóng)病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。第二部分：目的：Fd基因的原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。方法：首先犍從臨床分離的陰道毛流蟲(chóng)傳代數(shù)次后，調(diào)整蟲(chóng)量。超聲粉碎，制備可溶性全蟲(chóng)抗原，應(yīng)用Bardford法檢測(cè)抗原濃度。約300pg抗原與等量佐劑混合多點(diǎn)注射免疫家兔，制各抗陰道毛滴蟲(chóng)多克隆抗體?？寡逵肊LISA法檢測(cè)效價(jià)。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒p_IID18TFd經(jīng)雙酶切

3、后，亞克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pucl9，轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌的重組質(zhì)粒pUCl9一Fd經(jīng)Im誘導(dǎo)，SDSPAGB和Westernblot鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)情況。本研究同I橢Johnson教授惠贈(zèng)原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET3CFd轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，用IFFG誘導(dǎo)表達(dá)。因?yàn)殛幍烂蜗x(chóng)是屜原始的真核細(xì)胞，我們構(gòu)建了Fd基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA31(十)一Fd，為下一步研究打下基礎(chǔ)。結(jié)果：制備的可溶性全蟲(chóng)抗原，濃度是0449／L，免疫家兔后得到多

4、克隆抗體效價(jià)為I：8000以上，可用于westernblot的一抗以及其住的免疫反應(yīng)。構(gòu)建l簦JpUCl9Fd重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定正確，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE檢測(cè)在14(d處有新增蛋自條帶，Westernblot分析有陽(yáng)性雜交信號(hào)，說(shuō)明克隆寄勺Fd基因能夠表達(dá)，我們又用同樣方法表達(dá)了重組質(zhì)粒pET3CFd，為研究該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能創(chuàng)造了努彳牛。我們成功地亞克隆出真援表達(dá)重組重組質(zhì)粒pcDNA31()一Fd，為開(kāi)展下～步研究打下基礎(chǔ)。