缺鐵脅迫對(duì)海豚鏈球菌生長的影響及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(ftsABCD)的克隆與表達(dá).pdf

1、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)是一類重要的魚類病原菌，由該菌引起的魚類海豚鏈球菌病對(duì)當(dāng)今世界的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了能有效的控制海豚鏈球菌病，需要對(duì)海豚鏈球菌毒力因子進(jìn)行深入研究，尋找有效的抗原。鐵元素是一種生命必須的營養(yǎng)元素，眾多研究表明鐵元素作為一種重要的環(huán)境信號(hào)因子影響著細(xì)菌相關(guān)毒力基因的表達(dá)，另外，負(fù)責(zé)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的復(fù)合體屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，該轉(zhuǎn)運(yùn)體上的鐵元素受體結(jié)合蛋白具有一定的抗原性，能作為亞

2、單位疫苗的候選者之一?；谏鲜鲈颍疚倪x擇對(duì)海豚鏈球菌進(jìn)行鐵脅迫以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因的研究，希望能初步揭示鐵元素對(duì)海豚鏈球菌的重要作用，以及通過分子生物學(xué)方法找到海豚鏈球菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體并對(duì)受體蛋白的抗原性進(jìn)行驗(yàn)證，為亞單位疫苗的研制打下基礎(chǔ)。
　　 本研究使用次氮基三乙酸鈉鹽(Nitrilotriacetic acid trisodium salt，NTA)作為鐵螯合劑添加到腦心浸液培養(yǎng)基中人為制造缺鐵培養(yǎng)環(huán)境，觀察海豚鏈球菌的生長情況

3、。結(jié)果表明：加入終濃度為5mMNTA能夠延緩海豚鏈球菌HD-1菌株對(duì)數(shù)生長期時(shí)間6hr，且靜止期細(xì)菌密度是0.67，要顯著小于對(duì)照組0.77，且革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)細(xì)菌形成長鏈狀；加入終濃度為15mMNTA則完全抑制海豚鏈球菌HD-1生長，再加入100μM血紅蛋白或者100mM氯化鐵則細(xì)菌恢復(fù)生長。進(jìn)一步分析不同條件下生長的海豚鏈球菌細(xì)胞組分(SDS-PAGE電泳分析)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與5mMNTA處理組相比，其全菌可溶蛋白、全菌不可溶蛋白、原生

4、質(zhì)體破碎蛋白、胞壁蛋白、原生質(zhì)體不可溶蛋白、原生質(zhì)體可溶蛋白等成分均有差異。使用CAS檢測法未能檢測出海豚鏈球菌HD-1產(chǎn)生siderophore蛋白。此結(jié)果表明海豚鏈球菌并不是通過分泌siderophore來攝取鐵源，而是另有途徑。
　　 在對(duì)缺鐵脅迫培養(yǎng)條件下海豚鏈球菌的各種表觀特征進(jìn)行了初步研究后，本研究利用海豚鏈球菌ATCC9117菌株盲測序列數(shù)據(jù)庫，與從NCBI中獲得的釀膿鏈球菌FtsABCD鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列進(jìn)行tbla

5、stn，找到同源性較高的海豚鏈球菌相關(guān)基因，并命名為海豚鏈球菌ftsABCD。設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增基因全長后發(fā)現(xiàn)fsA基因全長783bp，編碼260個(gè)氨基酸；ftsB基因全長為927bp，編碼308個(gè)氨基酸；ftsC基因全長為1,029bp，編碼342個(gè)氨基酸；ftsD基因全長為999bp，編碼332個(gè)氨基酸。經(jīng)過生物信息學(xué)分析預(yù)測海豚鏈球菌FtsABCD為一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC transporter)，其中FtsA基因?yàn)锳TP水解酶

6、，F(xiàn)tsB為底物結(jié)合蛋白，F(xiàn)tsC與FtsD均為通透酶。
　　 通過克隆引入了BamHI、XhoI雙酶切位點(diǎn)的ftsB成熟肽序列，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21進(jìn)行FtsB重組蛋白的表達(dá)。通過優(yōu)化溫度、時(shí)間與誘導(dǎo)劑IPTG濃度，最終確定了重組蛋白表達(dá)的最佳條件。FtsB重組蛋白分子量為49.6kDa，由于其帶有組氨酸標(biāo)簽，因此用鎳柱對(duì)混合蛋白進(jìn)行純化，然后對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥濃縮。
　　

7、 將海豚鏈球菌HD-1通過腹腔注射到小鼠體內(nèi)，進(jìn)行人工感染，在感染后第10天取感染小鼠血清作為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗鼠抗體為二抗，對(duì)電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上的FtsB重組蛋白進(jìn)行western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一抗能特異性的檢測到FtsB重組蛋白。這表明海豚鏈球菌HD-1在感染小鼠的過程中，ftsB基因轉(zhuǎn)錄并表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物FtsB蛋白能被小鼠免疫系統(tǒng)識(shí)別為有效抗原并產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。因此，F(xiàn)tsB能夠作為亞單位疫苗有效抗原的候