重組人p53轉(zhuǎn)染淋巴瘤源性樹突狀細(xì)胞的抗腫瘤免疫效應(yīng).pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前已知唯一能激活初始T細(xì)胞(naive T cells)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，因其強(qiáng)大的抗原遞呈功能和激活抗原后特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes CTL)反應(yīng)，成為腫瘤生物免疫治療的重要載體，而淋巴瘤源性DC(L-DC)既帶有淋巴瘤瘤細(xì)胞抗原，同時(shí)又是抗原提呈細(xì)胞，來(lái)源于患者本

2、人，不存在MHC限制性，能有效地激活特異的抗腫瘤免疫，在淋巴瘤的生物免疫治療中發(fā)揮重要作用。但L-DC與正常人CD14+或CD34+前體細(xì)胞來(lái)源的CD83+的DC相比，其遷移、吞噬作用及抗原加工遞呈功能減弱，使抗腫瘤免疫應(yīng)答能力下降，同時(shí)由于腫瘤細(xì)胞釋放細(xì)胞免疫抑制因子，引起DC的免疫耐受，這樣就限制了DC在淋巴瘤免疫治療中的作用，如何獲得更具抗原遞呈功能的DC，打破免疫耐受，成為目前研究的熱點(diǎn)。有研究表明，p53基因突變和過(guò)度表達(dá)與N

3、HL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1]，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，其異常表達(dá)率可高達(dá)50％[2]。目前，體內(nèi)和體外試驗(yàn)，應(yīng)用重組人p53腺病毒(rAd-p53)，把wt-p53基因?qū)雽?shí)體瘤中或與實(shí)體瘤細(xì)胞株共培養(yǎng)，可產(chǎn)生瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)增強(qiáng)了放療的敏感性，從而使rAd-p53成為治療實(shí)體瘤另外一種途徑，為腫瘤的治療提供了一種新的cc武器”[3-10]。并且發(fā)現(xiàn)腺病毒p53修飾DC后可使其表達(dá)內(nèi)源性抗原，上調(diào)DC共刺激分子表達(dá)，產(chǎn)生特

4、異性CTL效應(yīng)。因此，如何獲得臨床上需要的有功能的L-DC及糾正瘤細(xì)胞內(nèi)的突變的p53基因的功能，是急需解決的問(wèn)題。目前，雖然分子靶向治療藥物的問(wèn)世，如CD20單抗(美羅華)等，使得DLBCL的治愈率提高了很多，但在淋巴瘤的治療中如何解決微小殘留病灶(MRD)、DC免疫耐受等問(wèn)題，仍然是目前臨床治療淋巴瘤遇到的難題，因此，我們利用rAd-p53能否誘導(dǎo)淋巴瘤瘤細(xì)胞為成熟DC，作為腫瘤疫苗治療淋巴瘤及解決MRD、DC免疫耐受問(wèn)題是本實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

5、的所在。 方法：采集經(jīng)病理確診的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的淋巴結(jié)和外周血的單個(gè)核細(xì)胞(MNC)進(jìn)行培養(yǎng)。分為3組：實(shí)驗(yàn)組A(淋巴結(jié)源性DC轉(zhuǎn)染rAd-p53，L-rAd-p53-DC)，實(shí)驗(yàn)組B(外周血源性DC轉(zhuǎn)染rAd-p53，P-rAd-p53-DC)：對(duì)照組A(淋巴結(jié)源性DC轉(zhuǎn)染tAd，L-rAd-DC)，對(duì)照組B(外周血源性DC轉(zhuǎn)染rAd，P-rAd-DC)；空白對(duì)照組A(淋巴結(jié)源性DC未轉(zhuǎn)染，L-N-DC)，空白對(duì)照組B(

6、外周血源性DC未轉(zhuǎn)染，P-N-DC)，以上各組均用GM-CSF+IL-4培養(yǎng)，至第7天，實(shí)驗(yàn)組加rAd-p53：對(duì)照組加rAd；空白對(duì)照組未加任何物質(zhì)；各組于培養(yǎng)第8天加入TNF-a+CD40mAb繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC免疫表型、酶聯(lián)免疫吸附法(EUSA)進(jìn)行上清夜IL-12水平測(cè)定，四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法觀察各組刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力(MLR)及乳酸脫氫酶(LDH)法針對(duì)淋巴瘤瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(CTL效應(yīng))。

7、在分離外周血過(guò)程中，貼壁的進(jìn)行DC培養(yǎng)，非貼壁的培養(yǎng)成效應(yīng)細(xì)胞。 結(jié)果：淋巴結(jié)源性和外周血源性的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后均成功獲得具有樹突狀突起的細(xì)胞，但以實(shí)驗(yàn)組樹突狀突起明顯。結(jié)果顯示：DC的表型(CD1a除外)CD83、CD80、CD86和HLA-DR實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組及空白對(duì)照組明顯增高(p<0.05)。上清液中IL-12分泌水平實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組及空白對(duì)照組明顯增高(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組具有明顯的刺激自體淋巴細(xì)胞增殖的能力，且

8、刺激能力隨rAd-p53-DC與淋巴細(xì)胞比例的增加而升高。對(duì)照組也能刺激同種自體淋巴細(xì)胞增殖的能力，但較實(shí)驗(yàn)組組差(p<0.05)。對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用(CTL效應(yīng))結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷率顯著高于對(duì)照組及空白對(duì)照組(P<0.05)。且實(shí)驗(yàn)組A的CTL效應(yīng)明顯高于實(shí)驗(yàn)組B，兩者之間有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：利用rAd-p53可以成功地誘導(dǎo)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤瘤細(xì)胞和外周血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察