糖尿病大鼠腎臟RAGE的表達(dá)及其與足細(xì)胞損傷的相關(guān)的研究.pdf

1、背景和目的：糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中高糖環(huán)境下產(chǎn)生的高級糖基化終產(chǎn)物與其細(xì)胞表面特異性受體的結(jié)合，在糖尿病靶組織的損傷中發(fā)揮了重要作用。RAGE作為高級糖基化終產(chǎn)物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，屬于細(xì)胞表面分子免疫超家族成員。許多研究顯示RAGE參與了包括糖尿病腎病在內(nèi)的糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展過程，而其多配體的特性，可能使其具有與其他高級糖基化終產(chǎn)物受體不同的作用機(jī)制。但RAGE在糖尿

2、病腎組織內(nèi)的表達(dá)水平如何，目前有關(guān)的研究甚少。足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和功能的改變與包括糖尿病腎病在內(nèi)的腎小球疾病密切相關(guān)。已有研究顯示，糖尿病時(shí)足細(xì)胞可發(fā)生足突融合、脫落、足細(xì)胞數(shù)量減少及損傷標(biāo)志(如結(jié)蛋白desmin)表達(dá)增加等變化；近來國外有報(bào)道糖尿病腎病時(shí)RAGE表達(dá)僅見于足細(xì)胞。但RAGE表達(dá)水平的改變與糖尿病腎病足細(xì)胞的損傷是否具有相關(guān)性，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用糖尿病大鼠模型，觀察了正常和糖

3、尿病大鼠腎組織中RAGE和足細(xì)胞損傷標(biāo)志desmin的表達(dá)水平，以及腎小球足細(xì)胞數(shù)的變化，以初步探討其在糖尿病腎病中的變化及臨床意義。 方法：雄性Wister大鼠26只，2月齡，體重230-320g(由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為正常對照組(n=8)和糖尿病組(n=18)。糖尿病組單次腹腔注射溶于枸櫞酸鹽緩沖液的鏈脲佐菌素(STZ，55mg/kg)誘發(fā)糖尿病模型，正常對照組注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。糖尿病誘導(dǎo)成功8周后處

4、死動(dòng)物。用免疫組化方法分別檢測RAGE和desmin在正常及糖尿病大鼠腎臟中的表達(dá)。采用MCIDAnalysisEvaluation7.0圖像分析軟件，對染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。每例切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，光鏡400倍下將圖像捕入圖像分析軟件系統(tǒng)，測量陽性細(xì)胞的平均光密度值和陽性細(xì)胞率，并計(jì)算腎小球desmin損傷指數(shù)；同時(shí)測量高倍視野(PAS染色×400)下10個(gè)腎小球面積(μm2)，同時(shí)計(jì)數(shù)高視野每個(gè)測量腎小球的足細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出每個(gè)腎小

5、球每1000μm2面積內(nèi)腎小球足細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表腎小球足細(xì)胞數(shù)。在370nm入射光下，用熒光顯微鏡觀察冷凍腎組織切片，記錄熒光顯微鏡的自動(dòng)攝片設(shè)備所顯示的曝光時(shí)間，以此時(shí)間間接反映腎組織AGEs含量。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量樣本均數(shù)組間的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；分級資料采用Ridit分析法。并分別對糖尿病組大鼠腎小球上RAGE的表達(dá)與腎小球足細(xì)胞數(shù)，腎小球desmin損傷指

6、數(shù)，糖化血紅蛋白(GHb)，肌酐清除率(Ccr)，24小時(shí)尿蛋白(24hUP)，糖化終末產(chǎn)物(AGEs)等進(jìn)行相關(guān)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.定位表達(dá) 1)對照組大鼠腎小球上于8周末檢測到RAGE表達(dá)；腎小管上幾乎沒有RAGE表達(dá)； 2)糖尿病組大鼠腎小球、腎小管上，于8周末均檢測到RAGE表達(dá)； 3)對照組和糖尿病組腎小球和腎小管上均檢測到desmin表達(dá)； 4)PBS

7、作為一抗陰性對照組，兩組腎組織均未檢測到RAGE、desmin表達(dá)。 2.定量分析 1)糖尿病組和對照組大鼠腎小球RAGE陽性細(xì)胞率分別為11.61±5.63，6.43±3.71；陽性細(xì)胞平均光密度值分別為0.242±0.059，0.108±0.020；糖尿病組RAGE表達(dá)明顯增加(P＜0.01)； 2)RAGE在正常大鼠腎小管上幾乎不表達(dá)，誘發(fā)糖尿病8周，糖尿病組RAGE陽性細(xì)胞率達(dá)6.02±5.73，陽性細(xì)胞

8、平均光密度值達(dá)0.054±0.021；糖尿病組RAGE表達(dá)無明顯增加(P＞0.05)； 3)糖尿病組和對照組大鼠腎小管desmin陽性細(xì)胞率分別為30.20±9.63，10.41±4.62；陽性細(xì)胞平均光密度值分別為0.298±0.072，0.238±0.084；兩組比較無顯著差異(P＞0.05)；糖尿病組和對照組大鼠腎小球desmin損傷指數(shù)分別為17.32±0.53，15.6±0.30；糖尿病組明顯增加(P＜0.01)；

9、 4)糖尿病組和對照組大鼠的腎小球足細(xì)胞數(shù)分別為7.12±1.14，11.23±1.01；糖尿病組明顯減少(P＜0.01)。 3.相關(guān)性分析 1)大鼠腎小球RAGE陽性細(xì)胞平均光密度值與糖化血紅蛋白(GHb)成正相關(guān)(r=0.838，P＜0.01)；與糖化終末產(chǎn)物(AGEs)熒光曝光時(shí)間、腎小球足細(xì)胞數(shù)成負(fù)相關(guān)(r=-0.746，P＜0.01；r=-0.736，P＜0.01)； 2)大鼠腎小球足細(xì)胞數(shù)與肌酐清

10、除率(Ccr)成正相關(guān)(r=0.616，P＜0.01)；與腎小球desmin損傷指數(shù)、24h尿蛋白(24hUP)成負(fù)相關(guān)(r=-0.732，P＜0.01；r=-0.846，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.正常狀態(tài)下大鼠腎小球、腎小管上有微弱的RAGE表達(dá)，糖尿病環(huán)境可誘導(dǎo)腎小球的RAGE表達(dá)明顯增加； 2.正常大鼠腎小球和腎小管上均有desmin表達(dá)，但高血糖僅使腎小球上的desmin表達(dá)明顯增加，而腎小管上des

11、min表達(dá)無明顯變化； 3.糖尿病環(huán)境使大鼠腎小球足細(xì)胞數(shù)減少，且腎小球足細(xì)胞數(shù)與Ccr成正相關(guān)，與腎小球desmin損傷指數(shù)、24hUP成負(fù)相關(guān)，提示腎小球足細(xì)胞數(shù)量減少是糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制之一，而desmin是足細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。 4.腎小球足細(xì)胞數(shù)與腎小球的RAGE表達(dá)強(qiáng)度成顯著負(fù)相關(guān)，提示腎小球RAGE表達(dá)增加在糖尿病時(shí)的足細(xì)胞損傷中具有重要作用，RAGE介導(dǎo)的細(xì)胞信號途徑可能參與了糖尿病時(shí)足細(xì)胞病變的發(fā)