化學性缺氧對原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞葡萄糖轉運蛋白4轉位的影響及信號調控機制.pdf

1、目的： 在心肌缺血、缺氧，心臟工作負荷增加以及肥厚性心肌病等病理情況下，心肌代謝以葡萄糖無氧酵解及乳酸氧化為主要能量來源。葡萄糖進入心肌細胞通過易化性葡萄糖轉運子(GLUTs)實現(xiàn)。GLUTs的質和量對葡萄糖跨膜轉運的速度起決定作用。其中GLUT-4廣泛分布于心肌細胞內，在胰島素及缺血/缺氧等因素作用下發(fā)生轉位，即從細胞內存儲囊泡轉位至細胞質膜。有研究表明胰島素介導的GLUT-4轉位為磷酸肌醇3-激酶(PI3K)介導，而缺血/缺

2、氧所致心肌GLUT-4轉位機制尚待闡明。有研究提示單磷酸腺苷-激活的蛋白激酶(AMPK)可能是缺血所致GLUT-4轉位的主要調節(jié)因素之一。本研究利用疊氮化合物誘導原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞發(fā)生化學性缺氧，觀察缺氧條件下心肌細胞葡萄糖攝取及GLUT-4轉位情況，進而探討調控該生物學過程的信號通路是否有AMPK參與。 方法： 首先應用低濃度疊氮鈉處理原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，通過細胞活力檢測(MTT法)以及凋亡過程分析(Ann

3、exin V-FITC+PI雙染流式細胞儀測凋亡)確定處理因素的最適條件(最適孵育時間及濃度)，制備科學的細胞化學性缺氧模型。然后用或不用氨基嘌呤9-β-D-阿糖呋喃腺苷(ara A，為AMPK抑制劑)預處理，將原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞隨機分組，分別進行疊氮鈉孵育(化學性缺氧)，胰島素處理，5-氨基咪唑-4-氨基酰-1β-核糖呋喃腺苷(AICAR，AMPK激活劑)處理等。應用γ-液閃儀測定各組細胞2-[3H]-脫氧葡萄糖(2-[3H]DG

4、)的攝取情況，同時通過蛋白質印記免疫分析法(western blot)檢測各組細胞膜成份中的GLUJT-4蛋白表達水平變化。最后通過AMPK活性檢測探討上述生物學改變的信號調控機制。 結果： 1mmol/L疊氮鈉孵育心肌細胞3小時，可以誘導心肌細胞發(fā)生可逆的化學性缺氧，該缺氧模型重復性好、科學性強、理論依據充分，可以用于心肌細胞缺氧的后續(xù)實驗研究中。 液閃測定各組心肌細胞2-[3H]DG 攝取率結果顯示，與胰島素

5、的作用相仿，AICAR及疊氮鈉均可使心肌細胞葡萄糖攝取率較基礎狀態(tài)顯著增加。二者聯(lián)合處理使心肌細胞葡萄糖攝取率增加較二者單純處理更顯著，而胰島素與AICAR聯(lián)合處理后細胞葡萄糖攝取率增加至各處理組中最大。同時，各組細胞膜組分的蛋白質印記免疫分析結果表明，AICAR和疊氮鈉均可增加心肌細胞GLUT-4轉位(自細胞內GLUT-4存儲囊泡至細胞膜)，且胰島素和AICAR聯(lián)合處理使心肌細胞GLUT-4轉位增加最顯著。 另一方面，araA

6、在抑制AMPK激活的同時，削弱了疊氮鈉、胰島素與AICAR聯(lián)合孵育所致的細胞葡萄糖攝取增加效應，并可完全阻斷AICAR引起的葡萄糖攝取增加。同時，araA顯著抑制了上述各組細胞的GLUT-4轉位(自細胞內GLUT-4存儲囊泡至細胞膜)。 結論： 低濃度疊氮鈉誘導原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞產生化學性缺氧，該過程為可逆的早期凋亡，此細胞缺氧模型可用于心肌缺血/缺氧相關的基礎研究中。 低濃度疊氮鈉所致化學性缺氧可以引起原代