高糖或缺氧對原代心肌細(xì)胞Nkx2-5、Tbx5表達(dá)的影響.pdf

1、目的:心臟是胚胎發(fā)育過程中第一個形成的器官，作為高度特化的器官，一直被認(rèn)為沒有再生的能力，受損后以瘢痕修復(fù)為主替代之，嚴(yán)重影響心肌收縮功能，是不可逆心衰的病理基礎(chǔ)。但在2011年P(guān)orrello等人手術(shù)切除1日齡小鼠15％的心室肌，21天后小鼠心臟完全再生且功能正常無瘢痕形成，證明哺乳動物心肌有再生能力;2013年Senyo等人證實(shí)哺乳動物預(yù)先存在的心肌細(xì)胞是維持心肌日常更替和受損后心肌再生的主要細(xì)胞來源。
　　Nkx2-5與其下

2、游基因Tbx5是心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子，是心肌前體細(xì)胞的標(biāo)志基因，在功能上緊密關(guān)聯(lián)。Nkx2-5、Tbx5隨著心臟發(fā)育成熟表達(dá)逐漸降低維持低水平狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)Nkx2-5、Tbx5表達(dá)升高與心肌再生相關(guān)。因此Nkx2-5、Tbx5表達(dá)升高是參與心肌再生的重要因素。
　　高糖或缺氧是臨床常見心肌受損因素，可導(dǎo)致心肌肥大和心肌纖維化，最終造成心臟功能不可逆損傷。高糖缺氧與損傷之間的關(guān)系認(rèn)識清楚，但高糖缺氧與心肌再生的關(guān)系沒有明確的認(rèn)識。

3、高糖或缺氧能否刺激心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、Tbx5表達(dá)上調(diào)參與心肌細(xì)胞再生未有報(bào)道。
　　高糖缺氧均可刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)活性增強(qiáng)，iNOS催化底物可以大量生成一氧化氮(NO)，過量NO和超氧陰離子迅速反應(yīng)生成的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)是已知氧化活性最強(qiáng)的一類物質(zhì)，也是體內(nèi)造成氧化應(yīng)激損傷的重要原因。那么，高糖缺氧刺激心肌細(xì)胞不同時間后iN

4、OS、Nkx2-5、Tbx5表達(dá)如何變化？ONOO-水平是否影響Nkx2-5、Tbx5表達(dá)未見報(bào)道。
　　通心絡(luò)是國藥準(zhǔn)字中藥復(fù)方制劑，是臨床用于治療心臟疾病的常用藥物。不同濃度通心絡(luò)干預(yù)高糖或缺氧刺激的原代心肌細(xì)胞是否影響iNOS、Nkx2-5、Tbx5表達(dá)未見研究。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在探討高糖或缺氧能否使原代心肌細(xì)胞Nkx2-5、Tbx5基因表達(dá)上調(diào);ONOO-水平是否是影響Nkx2-5、Tbx5表達(dá)的重要機(jī)制;不同濃度通心

5、絡(luò)的干預(yù)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)采用出生3天以內(nèi)SD大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞。免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞。檢測高糖或缺氧刺激原代心肌細(xì)胞不同時間iNOS、Nkx2-5、Tbx5基因的表達(dá);不同濃度的通心絡(luò)干預(yù)高糖或缺氧刺激的原代心肌細(xì)胞，檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因表達(dá);應(yīng)用ONOO-的供體(SIN-1)和清除劑(FeTTPs)，檢測ONOO-對Nkx2-5、Tbx5基因表達(dá)影響。
　　方法:
　　1.原代心肌細(xì)胞

6、分離及培養(yǎng)取出生3天以內(nèi)的SD大鼠乳鼠7-8只，75％酒精消毒，用眼科剪在胸骨角上2肋剪開胸腔，輕擠胸腔，擠出心臟，用鑷子取心臟，將取下的心臟剪碎，用胰酶少量多次消化組織塊，采用物理和化學(xué)方法去除成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞。用含15％胎牛血清的DMEM（低糖）的培養(yǎng)基接種于六孔板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7天用以實(shí)驗(yàn)。
　　2.分組
　　實(shí)驗(yàn)分為高糖組和缺氧組，應(yīng)用25mM的DMEM培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境，應(yīng)用終濃

7、度為100uM的氯化鈷模擬缺氧環(huán)境;
　　(1)檢測細(xì)胞在高糖刺激下不同時間iNOS，Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平，將細(xì)胞分為正常組（即0h組）、高糖刺激1h、2h、3h、4h、5h組。
　　(2)檢測ONOO-水平對Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細(xì)胞分為正常組，高糖組，高糖+鐵卟啉組，SIN-1組。
　　(3)檢測不同濃度通心絡(luò)在高糖刺激下對心肌細(xì)胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細(xì)胞分

8、為高糖組，通心絡(luò)360μg/ml組、通心絡(luò)540μg/ml組、通心絡(luò)720μg/ml組。
　　(4)檢測細(xì)胞在缺氧刺激下不同時間iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平，將細(xì)胞分為正常組（即0h組），缺氧1h、2h、3h、4h、5h組。
　　(5)檢測ONOO-水平對Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細(xì)胞分為正常組，缺氧組，缺氧+鐵卟啉組，SIN-1組。
　　(6)檢測不同濃度通心絡(luò)在缺氧刺激下對心肌細(xì)胞iNOS

9、、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細(xì)胞分為缺氧組，通心絡(luò)360μg/ml組、通心絡(luò)540μg/ml組、通心絡(luò)720μg/ml組。
　　3.形態(tài)學(xué)觀察
　　剛提取的心肌細(xì)胞為球形，12小時之后細(xì)胞基本貼壁，細(xì)胞逐漸伸出偽足，細(xì)胞與細(xì)胞之間逐漸建立聯(lián)系;48小時細(xì)胞逐漸出現(xiàn)跳動，細(xì)胞漸漸成片跳動，跳動頻率一致。
　　4.利用免疫熒光的方法檢測提取細(xì)胞中cTNT表達(dá)，鑒定心肌細(xì)胞5心肌細(xì)胞通過不同刺激培養(yǎng)后，檢測心肌

10、細(xì)胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　Trizol一步法提取心肌細(xì)胞中總RNA;用β-actin做內(nèi)參，RT-PCR方法檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.原代心肌細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng)采用胰酶消化法，首先將心臟剪碎，胰酶消化心肌組織塊，成功分離為單個心肌細(xì)胞;運(yùn)用差速貼壁法及化學(xué)方法除去成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞;高糖DMEM培養(yǎng)心肌細(xì)胞，相差顯微鏡下觀察剛?cè)〉?/p>

11、心肌細(xì)胞為球形、透亮、有立體感，且成活率高、存活時間長，細(xì)胞貼壁后逐漸伸出偽足建立細(xì)胞之間的聯(lián)系，48小時候細(xì)胞出現(xiàn)跳動，并且逐漸成片跳動，頻率一致;利用免疫熒光檢測到心肌細(xì)胞中表達(dá)心肌細(xì)胞特異蛋白cTnT，提示原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)成功。
　　2.1 心肌細(xì)胞在高糖刺激下培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h后檢測心肌細(xì)胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.1.1 高糖刺激心肌細(xì)胞后iNOS的表達(dá)量與0h

12、（0.0198±0.0023）相比，1h(0.1511±0.0078, P＜0.01)、2h(0.2193±0.0300, P＜0.01)、3h(0.1370±0.0079, P＜0.01)、4h(0.0792±0.0106, P＜0.05)、5h(0.1076±0.0102,P＜0.01)均顯著升高;
　　2.1.2 高糖刺激心肌細(xì)胞后Nkx2-5的表達(dá)量與0h相比，1h(0.0899±0.3012)無差異，2h（5.0721±

13、0.3238，P＜0.01）、3h（3.9528±0.4833，P＜0.01）、4h（3.6183±0.4822，P＜0.01）、5h（3.3206±0.3590，P＜0.01）顯著升高;
　　2.1.3 高糖刺激心肌細(xì)胞后Tbx5的表達(dá)量與0h相比，1h(2.4470±0.2681，P＜0.01)、2h(6.8240±0.3612, P＜0.01)、3h(3.3203±0.3412, P＜0.01)、4h（3.0649±0.34

14、78，P＜0.01）、5h（2.4626±0.3227，P＜0.01）均顯著升高;
　　2.2 升高或降低ONOO-水平，檢測正常組、高糖組、高糖+鐵卟啉培組，SIN-1組Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌細(xì)胞Nkx2-5的表達(dá)量與正常組相比，高糖組（7.8980±1.3253，P＜0.01）升高，高糖+鐵卟啉組（3.2280±0.8611）無顯著變化，SIN-1組（6.8

15、342±0.3039，P＜0.01）升高;
　　2.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌細(xì)胞Tbx5的表達(dá)量與正常組相比，高糖組（5.6467±0.3538，P＜0.01）升高，高糖+鐵卟啉組（1.4675±0.2194）無明顯變化，SIN-1組（5.7920±0.1311，P＜0.01）升高;
　　2.3 心肌細(xì)胞在高糖刺激下同時用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心絡(luò)，分別干預(yù)后檢測iNOS、Nkx

16、2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.3.1 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細(xì)胞iNOS的表達(dá)量與對照組（0.1697±0.0128）相比，360μg/ml組（0.1666±0.0318）無明顯變化，540μg/ml組（0.0908±0.0090，P＜0.01）、720μg/ml組（0.1182±0.0140，P＜0.05）顯著降低;
　　2.3.2 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細(xì)胞Nkx2-5的表達(dá)量與對照組（0.0436±0.

17、0038）相比，360μg/ml組（0.0452±0.0031）無明顯變化，540μg/ml組（0.0255±0.0013，P＜0.01）、720μg/ml組（0.0313±0.0025，P＜0.05）顯著降低;
　　2.3.3 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細(xì)胞Tbx5的表達(dá)量與對照組（0.1287±0.0253）相比，360μg/ml組（0.1087±0.0197）無明顯變化，540μg/ml組（0.0342±0.0040，P＜0.

18、01）、720μg/ml組（0.0481±0.0059，P＜0.05）顯著降低;
　　3.1 心肌細(xì)胞在缺氧刺激下培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h后檢測心肌細(xì)胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.1.1 缺氧刺激心肌細(xì)胞后iNOS的表達(dá)量與0h（0.0541±0.0071）相比，1h(0.3834±0.0468, P＜0.01)、2h(0.0282±0.0216, P＜0.01)、3h（0.15

19、34±0.0139，P＜0.05）顯著升高，4h（0.0745±0.0154）、5h（0.0679±0.0145）無明顯變化;
　　3.1.2 缺氧刺激心肌細(xì)胞后Nkx2-5的表達(dá)量與0h（0.0356±0.0050）相比，1h(0.1929±0.0186, P＜0.01)、2h(0.1191±0.0142, P＜0.01)、3h（0.0888±0.0124，P＜0.05）顯著升高，4h（0.0396±0.0063）、5h(0.0

20、328±0.0021)無明顯變化;
　　3.1.3 缺氧刺激心肌細(xì)胞后Tbx5的表達(dá)量與0h（0.1339±0.0059）相比，1h（0.3750±0.0173，P＜0.01）、2h（0.2353±0.0135，P＜0.01）顯著升高，3h（0.1413±0.0134）、4h（0.1556±0.0055）、5h(0.1767±0.0249)無明顯變化;
　　3.2 升高或降低ONOO-水平，檢測正常組，缺氧組，缺氧+鐵卟啉組

21、，SIN-1組Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌細(xì)胞Nkx2-5的表達(dá)量與正常組相比，缺氧組（5.4382±0.4141，P＜0.01）升高，缺氧+鐵卟啉組（1.7654±0.4388）無顯著變化，SIN-1組（5.3441±0.1602，P＜0.01）升高;
　　3.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌細(xì)胞Tbx5的表達(dá)量與正常組相比，缺氧組（7.4372±0.5549

22、，P＜0.01）升高，缺氧+鐵卟啉組（1.4635±0.1315）無顯著變化，SIN-1組（6.0329±0.3361，P＜0.01）升高;
　　3.3 心肌細(xì)胞在缺氧刺激下同時用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心絡(luò)，分別干預(yù)后檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.3.1 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細(xì)胞iNOS的表達(dá)量與對照組（0.0263±0.0022）相比，360μg/ml組（

23、0.0271±0.0019）無明顯變化，540μg/ml組（0.0133±0.0010，P＜0.01）、720μg/ml組（0.0112±0.0013，P＜0.01）顯著降低;
　　3.3.2 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細(xì)胞Nkx2-5的表達(dá)量與對照組（0.0213±0.0013）相比，360μg/ml組（0.0204±0.0019）無明顯變化，540μg/ml組（0.0134±0.0019，P＜0.05）、720μg/ml組（0.

24、0113±0.0017，P＜0.01）顯著降低;
　　3.3.3 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細(xì)胞Tbx5的表達(dá)量與對照組（0.0333±0.0029）相比，360μg/ml組(0.0310±0.0021)、540μg/ml組（0.0307±0.0025）無明顯變化、720μg/ml組（0.0158±0.0008，P＜0.01）顯著降低;
　　結(jié)論:
　　1.高糖或缺氧可以使原代心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、Tbx5表