二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SalK-SalR調(diào)控高致病性2型豬鏈球菌毒力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、2型豬鏈球菌(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)是一種重要的人畜共患傳染病病原體。S.suis2感染不僅可致豬急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及急性死亡，并且可通過傷口和呼吸道等傳播途徑，導(dǎo)致人的感染發(fā)病和死亡。本病呈全球性分布，不僅給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的健康亦構(gòu)成嚴(yán)重威脅，已成為重要的新發(fā)傳染病病原體。1998年和2005年我國江蘇省和四川省分別暴發(fā)大規(guī)模S.su

2、is2感染疫情，病人中出現(xiàn)高比例的、國內(nèi)外罕見的鏈球菌中毒性休克綜合征(streptococcaltoxicshocksyndrome，STSS)，呈現(xiàn)高侵襲、深部組織感染的特點(diǎn)，病情兇險(xiǎn)，病死率高(62.7％～81.3％)，引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件。 為了對(duì)造成這兩次突發(fā)感染事件的S.suis2流行菌株的高致病性進(jìn)行深入研究，本課題組對(duì)1998年江蘇流行的強(qiáng)致病株98HAH12和2005年四川流行的強(qiáng)致病株05ZYH33(兩株均

3、分離自STSS病人)進(jìn)行了全基因組測序和功能注釋。將98HAH12和05ZYH33的基因組與Sanger研究中心公布的標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)1/7全基因組序列進(jìn)行共線性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)89kb大小的核酸片段為98HAH12和05ZYH33這兩個(gè)強(qiáng)致病株所特有，我們將這個(gè)特異性的片段命名為89K。隨后對(duì)分離自這兩次疫情爆發(fā)現(xiàn)場豬和人的15個(gè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均含有這段89K序列。有意義的是，國內(nèi)無毒株和本室保存的國際標(biāo)準(zhǔn)株及各國分離的致病株均

4、擴(kuò)增不到該片段。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，這個(gè)89K具備典型的毒力島(pathogenicity.island，PAI)特征。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示中國強(qiáng)致病株中的89K片段很可能是S.suis2通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得的一個(gè)毒力島，使得原本沒有毒力或者毒力較弱的菌株發(fā)生了毒力變異，從而引起這兩次S.suis2疫情大規(guī)模流行。 然而，我們預(yù)測89K毒力島完全是基于生物信息學(xué)分析的結(jié)果，缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。為了從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)89K這

5、個(gè)潛在的毒力島，我們對(duì)89K上的基因組織和分布進(jìn)行了仔細(xì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段上存在有2組二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-componentslgnaltransductionsystem，TCS)。大量研究表明，TCS作為致病菌中普遍存在的一種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在調(diào)節(jié)毒力基因表達(dá)和構(gòu)成細(xì)菌致病性等方面發(fā)揮著重要的作用。鑒于此，為揭示89K這個(gè)疑似的毒力島，闡明它與S.suis05ZYH33強(qiáng)致病性的關(guān)系，本文將研究對(duì)象鎖定在其中一個(gè)二元信號(hào)轉(zhuǎn)

6、導(dǎo)系統(tǒng)SalK/SalR上，對(duì)其進(jìn)行了深入細(xì)致的生物學(xué)功能研究。其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下幾個(gè)方面： 1.S.suis05ZYH33高效電轉(zhuǎn)化方法的建立：采用電穿孔的方法對(duì)S.suis2強(qiáng)致病株05ZYH33進(jìn)行外源DNA的轉(zhuǎn)化，通過調(diào)整參數(shù)，對(duì)影響電轉(zhuǎn)化效率的主要因素進(jìn)行探索。結(jié)果在S.suis05ZYH33中成功建立了一套高效穩(wěn)定的電轉(zhuǎn)化體系。在電轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置為22.5kV/cm電場強(qiáng)度、500Ω電阻和25μF電容的條件下，

7、用1ng/μl的大腸桿菌-豬鏈球菌穿梭質(zhì)粒pSET2可實(shí)現(xiàn)S.suis05ZYH33的高效電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107/μgDNA。同時(shí)發(fā)現(xiàn)壯觀霉素抗性基因SpcR可以作為S.suis2基因敲除實(shí)驗(yàn)中一個(gè)良好的篩選標(biāo)記。 2.S.suis05ZYH33SalK/SalR基因敲除突變株的構(gòu)建：以S.suis05ZYH33基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增SalK/SalR編碼基因的上下游片段；同時(shí)以pSET2穿梭質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)

8、增壯觀霉素抗性基因SpcR，在限制性內(nèi)切酶和T4連接酶的作用下，將它們依次克隆到pUC18載體的多克隆位點(diǎn)上，形成一個(gè)在SpcR兩側(cè)具有與靶基因同源序列的SalK/SalR基因敲除載體pUC：：salKR。將pUC：：salKR電轉(zhuǎn)化05ZYH33感受態(tài)細(xì)菌，篩選具有壯觀霉素抗性的S.suis2菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提基因組DNA，采用組合PCR驗(yàn)證和Southern雜交的方法證實(shí)SalK/SalR編碼基因已被SpcR替換掉，從而獲得具有壯

9、觀霉素抗性的SalK/SalR基因敲除突變株ΔsalKR。隨后，PCR擴(kuò)增出salK/SalR編碼基因及其上游啟動(dòng)子序列，并克隆至穿梭質(zhì)粒pSET1，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化突變株ΔsalKR，通過抗性篩選和PCR鑒定獲得SalK/SalR功能代償?shù)幕パa(bǔ)株CΔsalKR。 3.SalK/SalR缺失對(duì)細(xì)菌基本生物學(xué)性狀的影響：在相同的條件下，觀察S.suis2野生株05ZYH33與突變株ΔsalKR的基本生物學(xué)性狀有無明顯差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

10、，SalK/SalR編碼基因敲除后，細(xì)菌能穩(wěn)定生長，壯觀霉素抗性表型能夠在突變株中穩(wěn)定傳代。同時(shí)，SalK/SalR的缺失未明顯影響細(xì)菌的生長曲線、染色情況、結(jié)構(gòu)形態(tài)、溶血活性以及對(duì)過氧化氫敏感性等生物學(xué)特性。但是與野生株05ZYH33相比，突變株ΔsalKR抵抗中細(xì)粒細(xì)胞殺菌的能力顯著降低。 4.SalK/SalR缺失對(duì)細(xì)菌毒力的影響： ①用同等劑量(108CFu)的野生株05ZYH33、突變株ΔsalKR、互補(bǔ)株CΔ

11、salKR和無毒株05HAS68分別攻擊長白仔豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生株05ZYH33對(duì)動(dòng)物有致死性，而SalK/SalR缺失的突變株則喪失了對(duì)宿主動(dòng)物的致病性，互補(bǔ)株CΔsalKR能恢復(fù)對(duì)動(dòng)物的強(qiáng)致病性。 ②用等比例的野生株/突變株混合菌感染長白仔豬，對(duì)易感組織中的細(xì)菌進(jìn)行回收培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SalK/SalR缺失突變株在各組織中的定植能力嚴(yán)重下降。在與野生株共感染的情況下，突變株尚能在部分被檢組織(扁桃體、心、。腎和腦)中少量

12、的定植，單純用突變株進(jìn)行感染則細(xì)菌完全不能在任何組織中定植。 5.SalK/SalR調(diào)控S.suis05ZYH33致病性的作用機(jī)制分析：利用CombiMatrix基因芯片比較SalK/SalR缺失前后細(xì)菌的基因表達(dá)譜差異，結(jié)合定量PCR對(duì)芯片數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果在突變株ΔsalKR中共發(fā)現(xiàn)26個(gè)顯著下調(diào)的基因，主要編碼物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、DNA的重組修復(fù)和轉(zhuǎn)錄、膜蛋白以及一些功能未知的蛋白。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)潛在的毒力相關(guān)基因(05S

13、SU1009和05SSU0451)，分別編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶。 綜上所述，本研究為了從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)S.suis2中國強(qiáng)致病株中89K這個(gè)潛在的毒力島，針對(duì)性地從該島上選取了一個(gè)二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)SalK/SalR作為研究對(duì)象，通過基因敲除技術(shù)獲得了SalK/SalR缺失的突變株。體外實(shí)驗(yàn)顯示SalK/SalR的缺失未明顯影響細(xì)菌的生長、形態(tài)結(jié)構(gòu)、溶血活性等基本性狀，但是突變株抵抗中細(xì)粒細(xì)胞殺菌的能力顯著降低。

14、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SalK/SalR缺失后的突變株喪失了對(duì)宿主動(dòng)物的致病性，而SalK/SalR功能互補(bǔ)的菌株能恢復(fù)對(duì)動(dòng)物的強(qiáng)致病性，表明SalK/SalR對(duì)于S.suis05ZYH33的強(qiáng)致病性是必不可少的，這在國際上還是首次報(bào)道SalK/SalR與細(xì)菌的毒力密切相關(guān)?；蛐酒芯拷Y(jié)果顯示SalK/SalR的缺失會(huì)導(dǎo)致26個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)顯著的下調(diào)，其中有2個(gè)可能是潛在的毒力因子。本文研究結(jié)果不僅從實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了毒力島89K的客觀真實(shí)性