TGF-β1及其Ⅰ型受體的表達(dá)和血管密度在大鼠腦缺血再灌注后的變化.pdf

1、目的：在前期實驗“內(nèi)皮抑素和E/V比值在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用”的研究基礎(chǔ)上，進一步探討大鼠腦缺血再灌注損傷后TGF-β1及其I型受體-ALK1、ALK5的表達(dá)變化和血管密度的變化及它們之間的相關(guān)性。 方法：將56只雄性成年wistar大鼠隨機分為2組：假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=48)。其中模型組根據(jù)再灌注的時間分為6小時，1天，2天，3天，4天和7天6個組，每組8只。采用改良的Zea Longa線栓法，建立大鼠左側(cè)

2、大腦中動脈栓塞(MCAO)缺血再灌注模型。參照Zea Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)評分，假手術(shù)組組大鼠手術(shù)后l天、模型組大鼠再灌注達(dá)到相應(yīng)的觀察時間點時，將大鼠處死后斷頭取腦，取梗死灶腦組織：1)TTC染色。2)HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化。3)免疫組化法分別檢測CD105、TGF-β1l及其Ⅰ型受體的蛋白分布。4)CD105陽性細(xì)胞用來計數(shù)微血管密度。5)實時定量PCR法檢測mRNA水平的變化。6)分析ALK1和ALK5與血管密度的相關(guān)

3、性。 結(jié)果：1)病理改變與假手術(shù)組相比，大鼠腦缺血90min再灌注后病理改變較明顯。再灌注6h缺血側(cè)錐體細(xì)胞輕度腫脹，胞漿水腫，胞漿淡染，少數(shù)出現(xiàn)核深染。部分神經(jīng)元體積有所縮小呈三角形或長條形，與周圍組織脫離，胞漿空泡狀。再灌注1d，神經(jīng)元體積明顯縮小，胞核固縮深染，尼氏小體減少或消失，間質(zhì)水腫明顯，神經(jīng)纖維走行不清，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次明顯減少。再灌注2d，缺血中心組織疏松，形似海綿，點狀壞死灶形成，神經(jīng)纖維走行消失，可見白細(xì)胞

4、浸潤，偶見膠質(zhì)細(xì)胞增生。再灌注3d，錐體細(xì)胞大量缺失、變性、壞死，出現(xiàn)大片壞死灶，膠質(zhì)細(xì)胞增生，齒狀回顆粒細(xì)胞變性呈空泡樣。再灌注4d到7d缺血灶周圍大量膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞增生，聚集成堆；2)蛋白的定性表達(dá)CD105陽性細(xì)胞定位于所有血管內(nèi)皮細(xì)胞，但主要位于毛細(xì)血管。免疫組化染色顯示在假手術(shù)組可見少量的低表達(dá)的TGF-β1免疫陽性細(xì)胞；缺血再灌注后，TGF-β1蛋白在缺血周圍區(qū)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)增多。ALKl在假手術(shù)組中即有明顯表達(dá)，主

5、要在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。再灌注后，表達(dá)強度有所減弱。假手術(shù)組中，ALK5在個別細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)；缺血再灌注后，ALK5除在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多外，少數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達(dá)；3)血管密度的改變假手術(shù)組的血管密度為34.23±1.45。再灌注6h后，微血管密度較假手術(shù)組有所升高，再灌注ld繼續(xù)升高到44.10±18.30，但與假手術(shù)組相比其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。再灌注2d時，微血管密度結(jié)果出現(xiàn)下降的趨勢，3d時降至15.50±

6、5.72(P<0.05)。再灌注4d時，微血管密度有所回升，到7天時升至38.85±11.55，與假手術(shù)組相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義；4)mRNA水平的變化以假手術(shù)組為參照，其各個指標(biāo)的mRNA的表達(dá)量均定為1。缺血再灌注后各時間點， TGF-β1mRNA水平較假手術(shù)組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。再灌注后6h至1d，其水平逐漸升高(P<0.01)，2d時有所回落(P(0.05vs假手術(shù)組)，再灌注3d至7d，又出現(xiàn)升高的趨勢，7d時升至

7、最高，其表達(dá)水平約為假手術(shù)組的5倍(P0.01)。ALKlmRNA缺血再灌注后持續(xù)低表達(dá)，與假手術(shù)組相比，2d時降至最低，其表達(dá)水平僅為假手術(shù)組的44％(P<0.01)，再灌注后3d時有所回升(P<0.05)，4d時進一步回升，但仍低于假手術(shù)組，再灌注7d時再次下調(diào)至假手術(shù)組水平的46％(P<0.01)。ALK5mRNA再灌注早期無明顯變化，1d時開始上升，2d和3d時繼續(xù)上升，但無統(tǒng)計學(xué)意義，4d達(dá)峰值，其表達(dá)約為假手術(shù)組的4倍(P<

8、0.01)，再灌注7d時有所回落，但與假手組相比，仍有顯著性差異(P<0.01)；5)ALKlmRNA的表達(dá)變化與血管密度的變化呈正相關(guān)(r=0.370，P<0.05)；而ALK5mRNA的表達(dá)變化與血管密度的變化無相關(guān)性(P=0.182)。 結(jié)論：缺血再灌注后，TGF-β1主要在缺血周圍區(qū)的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；ALK1主要在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)；ALKS主要在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，少數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達(dá)。缺血再

9、灌注后，微血管密度先升后降，第三天達(dá)最低；TGF-β1mRNA和ALK5mRNA再灌注后總體上呈持續(xù)高表達(dá)趨勢，前者7天時達(dá)最高，但2天時有一反降過程，而后者4天時即達(dá)高峰；ALK1mRNA于再灌注后呈顯著低表達(dá)，以2天、3天時最低，其變化與血管密度的變化呈正相關(guān)。未缺血時以ALK1受體的表達(dá)為主，缺血再灌注后ALK5受體的表達(dá)變得活躍；TGF-β1、ALKl和ALK5并不局限在一種細(xì)胞中表達(dá)，推測不同的細(xì)胞間可能相互作用，傳導(dǎo)TGF-