浙江省副豬嗜血桿菌血清型調查和IscR對莢膜多糖合成相關基因表達的影響.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPs）可以引起以纖維素性漿膜炎、關節(jié)炎以及腦膜腦炎等為主要病變的革拉斯氏?。℅l(a)ser's disease）。Hps的血清型普遍被視為判斷其毒力的重要標志之一。IscR是轉錄調節(jié)因子，具有特殊的結構可以結合特定的DNA片段，從而調控基因的轉錄。因此本文主要研究了近幾年浙江省HPs的血清型流行情況及IscR與莢膜多糖合成相關基因之間的作用。
　　通過PCR擴增的方法鑒

2、定2010-2015年從浙江省113個豬場中分離鑒定的HPs血清型，同時檢測6個可能與HPs毒力相關的基因(B14、D45、nhaC、fhuA、hhdA、hhdB)，分析其與血清型的相關性。結果表明，浙江省HPs近幾年的優(yōu)勢血清型為5/12型、4型、13型和14型，未檢測到3型、9型、11型和15型;2010-2015年HPs的主要血清型流行趨勢并未發(fā)生明顯改變，部分豬場存在兩種血清型菌株共感染的現(xiàn)象。對潛在毒力基因的檢測結果表明，D4

3、5基因在毒力菌株中出現(xiàn)的比例(82.4-87.5％)高于其在無毒力菌株中的檢測比例(50％);fhuA基因在強毒力菌株中的檢測比例(55％)卻低于其在中等毒力和無毒力菌株中的檢測比例(70.6-90％);其他四個毒力基因(B14、nhaC、hhdA、hhdB)在所有菌株中均有較高的比例，因此，潛在的毒力基因與血清型之間并沒有明確的相關性。
　　通過RT-PCR方法檢測并比較野毒株(290A1-WT)和IscR基因缺失株（290A1

4、-ΔIscR）內構成CPS基因簇相關基因funA、wbgY、capD、wza、funK和IscR的表達量差異;以透射電鏡觀察兩菌株體外培養(yǎng)時和與豬血清作用后菌體表面莢膜的差異。結果表明:體外培養(yǎng)時，IscR基因缺失株wza的表達量一直高于野毒株的表達，在OD600值為0.2時差異顯著(P＜0.05)，而capD在OD600值為0.2時表達量顯著低于野毒株(P＜0.05);所檢其他基因的表達量無明顯差異。當菌株與豬血清作用后，IscR基因

5、缺失株中的capD、wza和funK的表達量均顯著高于野毒株(P＜0.05);在血清作用10 min時，funA的表達量顯著低于野毒株(P＜0.05);在血清作用20 min后，wbgY的表達量顯著高于野毒株(P＜0.05)。透射電鏡結果顯示，與豬血清作用前兩菌株均無明顯莢膜生成，與豬血清作用10min后290A1-WT莢膜厚度達到100nm，而290A1-ΔIscR仍無明顯莢膜生成。
　　為了探究IscR蛋白的結合靶位點，本文選

6、取HPs的莢膜合成相關基因capD和wza的啟動子序列（p-capD和p-wza）進行電泳遷移率改變實驗(EMSA)。同時制備副豬嗜血桿菌IscR蛋白的多抗血清，通過Western blot觀察IscR是否可以在體外進行表達。結果表明，并未發(fā)現(xiàn)IscR蛋白與兩個啟動子序列直接結合;通過Western blot并不能在體外培養(yǎng)的菌體中發(fā)現(xiàn)IscR蛋白。
　　綜上所述，本實驗明確了近幾年浙江省內HPs流行株的血清型，為HPs的防控提供