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文檔簡介
1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPs)可以引起以纖維素性漿膜炎、關節(jié)炎以及腦膜腦炎等為主要病變的革拉斯氏?。℅l(a)ser's disease)。Hps的血清型普遍被視為判斷其毒力的重要標志之一。IscR是轉錄調節(jié)因子,具有特殊的結構可以結合特定的DNA片段,從而調控基因的轉錄。因此本文主要研究了近幾年浙江省HPs的血清型流行情況及IscR與莢膜多糖合成相關基因之間的作用。
通過PCR擴增的方法鑒
2、定2010-2015年從浙江省113個豬場中分離鑒定的HPs血清型,同時檢測6個可能與HPs毒力相關的基因(B14、D45、nhaC、fhuA、hhdA、hhdB),分析其與血清型的相關性。結果表明,浙江省HPs近幾年的優(yōu)勢血清型為5/12型、4型、13型和14型,未檢測到3型、9型、11型和15型;2010-2015年HPs的主要血清型流行趨勢并未發(fā)生明顯改變,部分豬場存在兩種血清型菌株共感染的現(xiàn)象。對潛在毒力基因的檢測結果表明,D4
3、5基因在毒力菌株中出現(xiàn)的比例(82.4-87.5%)高于其在無毒力菌株中的檢測比例(50%);fhuA基因在強毒力菌株中的檢測比例(55%)卻低于其在中等毒力和無毒力菌株中的檢測比例(70.6-90%);其他四個毒力基因(B14、nhaC、hhdA、hhdB)在所有菌株中均有較高的比例,因此,潛在的毒力基因與血清型之間并沒有明確的相關性。
通過RT-PCR方法檢測并比較野毒株(290A1-WT)和IscR基因缺失株(290A1
4、-ΔIscR)內構成CPS基因簇相關基因funA、wbgY、capD、wza、funK和IscR的表達量差異;以透射電鏡觀察兩菌株體外培養(yǎng)時和與豬血清作用后菌體表面莢膜的差異。結果表明:體外培養(yǎng)時,IscR基因缺失株wza的表達量一直高于野毒株的表達,在OD600值為0.2時差異顯著(P<0.05),而capD在OD600值為0.2時表達量顯著低于野毒株(P<0.05);所檢其他基因的表達量無明顯差異。當菌株與豬血清作用后,IscR基因
5、缺失株中的capD、wza和funK的表達量均顯著高于野毒株(P<0.05);在血清作用10 min時,funA的表達量顯著低于野毒株(P<0.05);在血清作用20 min后,wbgY的表達量顯著高于野毒株(P<0.05)。透射電鏡結果顯示,與豬血清作用前兩菌株均無明顯莢膜生成,與豬血清作用10min后290A1-WT莢膜厚度達到100nm,而290A1-ΔIscR仍無明顯莢膜生成。
為了探究IscR蛋白的結合靶位點,本文選
6、取HPs的莢膜合成相關基因capD和wza的啟動子序列(p-capD和p-wza)進行電泳遷移率改變實驗(EMSA)。同時制備副豬嗜血桿菌IscR蛋白的多抗血清,通過Western blot觀察IscR是否可以在體外進行表達。結果表明,并未發(fā)現(xiàn)IscR蛋白與兩個啟動子序列直接結合;通過Western blot并不能在體外培養(yǎng)的菌體中發(fā)現(xiàn)IscR蛋白。
綜上所述,本實驗明確了近幾年浙江省內HPs流行株的血清型,為HPs的防控提供
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