浙江省副豬嗜血桿菌血清型調(diào)查和IscR對(duì)莢膜多糖合成相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPs）可以引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜腦炎等為主要病變的革拉斯氏?。℅l(a)ser's disease）。Hps的血清型普遍被視為判斷其毒力的重要標(biāo)志之一。IscR是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有特殊的結(jié)構(gòu)可以結(jié)合特定的DNA片段，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。因此本文主要研究了近幾年浙江省HPs的血清型流行情況及IscR與莢膜多糖合成相關(guān)基因之間的作用。
　　通過PCR擴(kuò)增的方法鑒

2、定2010-2015年從浙江省113個(gè)豬場(chǎng)中分離鑒定的HPs血清型，同時(shí)檢測(cè)6個(gè)可能與HPs毒力相關(guān)的基因(B14、D45、nhaC、fhuA、hhdA、hhdB)，分析其與血清型的相關(guān)性。結(jié)果表明，浙江省HPs近幾年的優(yōu)勢(shì)血清型為5/12型、4型、13型和14型，未檢測(cè)到3型、9型、11型和15型;2010-2015年HPs的主要血清型流行趨勢(shì)并未發(fā)生明顯改變，部分豬場(chǎng)存在兩種血清型菌株共感染的現(xiàn)象。對(duì)潛在毒力基因的檢測(cè)結(jié)果表明，D4

3、5基因在毒力菌株中出現(xiàn)的比例(82.4-87.5％)高于其在無毒力菌株中的檢測(cè)比例(50％);fhuA基因在強(qiáng)毒力菌株中的檢測(cè)比例(55％)卻低于其在中等毒力和無毒力菌株中的檢測(cè)比例(70.6-90％);其他四個(gè)毒力基因(B14、nhaC、hhdA、hhdB)在所有菌株中均有較高的比例，因此，潛在的毒力基因與血清型之間并沒有明確的相關(guān)性。
　　通過RT-PCR方法檢測(cè)并比較野毒株(290A1-WT)和IscR基因缺失株（290A1

4、-ΔIscR）內(nèi)構(gòu)成CPS基因簇相關(guān)基因funA、wbgY、capD、wza、funK和IscR的表達(dá)量差異;以透射電鏡觀察兩菌株體外培養(yǎng)時(shí)和與豬血清作用后菌體表面莢膜的差異。結(jié)果表明:體外培養(yǎng)時(shí)，IscR基因缺失株wza的表達(dá)量一直高于野毒株的表達(dá)，在OD600值為0.2時(shí)差異顯著(P＜0.05)，而capD在OD600值為0.2時(shí)表達(dá)量顯著低于野毒株(P＜0.05);所檢其他基因的表達(dá)量無明顯差異。當(dāng)菌株與豬血清作用后，IscR基因

5、缺失株中的capD、wza和funK的表達(dá)量均顯著高于野毒株(P＜0.05);在血清作用10 min時(shí)，funA的表達(dá)量顯著低于野毒株(P＜0.05);在血清作用20 min后，wbgY的表達(dá)量顯著高于野毒株(P＜0.05)。透射電鏡結(jié)果顯示，與豬血清作用前兩菌株均無明顯莢膜生成，與豬血清作用10min后290A1-WT莢膜厚度達(dá)到100nm，而290A1-ΔIscR仍無明顯莢膜生成。
　　為了探究IscR蛋白的結(jié)合靶位點(diǎn)，本文選

6、取HPs的莢膜合成相關(guān)基因capD和wza的啟動(dòng)子序列（p-capD和p-wza）進(jìn)行電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)(EMSA)。同時(shí)制備副豬嗜血桿菌IscR蛋白的多抗血清，通過Western blot觀察IscR是否可以在體外進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，并未發(fā)現(xiàn)IscR蛋白與兩個(gè)啟動(dòng)子序列直接結(jié)合;通過Western blot并不能在體外培養(yǎng)的菌體中發(fā)現(xiàn)IscR蛋白。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)明確了近幾年浙江省內(nèi)HPs流行株的血清型，為HPs的防控提供