稻瘟菌效應(yīng)因子AvrPiz-t及其水稻靶蛋白APIP12的功能研究.pdf

1、植物在與病原微生物的自然競爭過程中，進(jìn)化出兩個(gè)層次的免疫系統(tǒng)來識(shí)別和防御病原物。第一層是由植物跨膜受體類蛋白識(shí)別病原物模式分子觸發(fā)的免疫(PTI)。第二層是由植物抗病蛋白(R)識(shí)別病原茵的效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫(ETI)。本課題組在水稻Piz-t基因克隆的基礎(chǔ)上，圖位克隆了其對(duì)應(yīng)的稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t，并利用酵母雙雜交技術(shù)從水稻cDNA文庫篩選到12個(gè)AvrPiz-t互作蛋白(APIPs)，同時(shí)借助于核磁共振技術(shù)與合作實(shí)驗(yàn)室解析了

2、AvrPiz-t的三維溶液結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，本文開展了對(duì)稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t和水稻互作蛋白APIP12的研究，主要結(jié)果如下:
　　1.利用已有的蛋白溶液結(jié)構(gòu)信息，對(duì)AvrPiz-t預(yù)測的功能相關(guān)的氨基酸和表面分布的堿性氨基酸通過構(gòu)建不同表達(dá)載體進(jìn)行了突變，分別進(jìn)行了功能互補(bǔ)，蛋白互作和亞細(xì)胞定位的研究。在AvrPiz-t突變體轉(zhuǎn)化稻瘟菌接種水稻的功能互補(bǔ)研究中，參與蛋白去泛素化的催化中心的H25A和N64A兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸

3、突變都失去了無毒功能，而相鄰的Q22A的突變不影響其無毒功能，表明催化中心的氨基酸對(duì)AvrPiz-t的功能非常重要。與12個(gè)APIP蛋白的酵母雙雜互作研究中，C23A、H25A、A41V和C70A四個(gè)催化中心相關(guān)的氨基酸殘基突變體與APIP2、APIP6和APIP10泛素化功能相關(guān)的互作都明顯變?nèi)趸蛲耆?，進(jìn)一步證明了AvrPiz-t的去泛素化活性中心氨基酸與泛素化蛋白的緊密聯(lián)系。同時(shí)，在互補(bǔ)分析中未失去無毒功能的Q22A和D89A突

4、變與12個(gè)APIP蛋白的互作也無明顯變化，表明AvrPiz-t的功能與APIP蛋白的互作存在著正相關(guān)性。在亞細(xì)胞定位的研究中，AvrPiz-t在細(xì)胞中的位置與葉綠體重合，而氨基酸的突變基本不影響其亞細(xì)胞定位的變化。
　　2.APIP12是AvrPiz-t在水稻中的互作蛋白，在N端和C端各有一個(gè)結(jié)構(gòu)域與核孔蛋白Nup98同源，但不包含F(xiàn)G重復(fù)結(jié)構(gòu)域，剩余序列在其它物種中找不到同源序列，因此APIP12可能是水稻的特有基因。我們通過酵

5、母雙雜和GSTPull-down驗(yàn)證了AvrPiz-t與APIP12的相互作用。水稻接種稻瘟菌后APIP12的表達(dá)都明顯上調(diào)，表明APIP12參與了水稻稻瘟病的抗病反應(yīng)。水稻中花11的APIP12基因敲除突變體和日本晴APIP12 RNAi轉(zhuǎn)基因系對(duì)稻瘟病的感病性增加，而且PR10等基因在敲除系中的表達(dá)下降。在Piz-t水稻中敲除或過表達(dá)APIP12不會(huì)影響其對(duì)含AvrPiz-t稻瘟菌的抗病性，而且APIP12與Piz-t的LRR，NT

6、和NBS結(jié)構(gòu)域在酵母雙雜實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到互作，表明APIP12在Piz-t介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中并不重要。APIP12的位于細(xì)胞質(zhì)中的未知結(jié)構(gòu)內(nèi)，但AvrPiz-t與APIP12共轉(zhuǎn)化煙草時(shí)，AvrPiz-t能夠與APIP12共定位，表明APIP12可能會(huì)與AvrPiz-t結(jié)合而改變其位置。APIP12與其它APIP蛋白中的APIP6和APIP8都能發(fā)生相互作用，因此這些APIP蛋白不是獨(dú)立存在的，APIP之間也存在相互作用。