基質(zhì)金屬蛋白酶-9在糖尿病性視網(wǎng)膜血視網(wǎng)膜屏障功能損害中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞試驗(yàn)部分：糖基化終產(chǎn)物對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP9表達(dá)的影響及機(jī)制研究 目的：研究糖基化終產(chǎn)物(AGEs)處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP9表達(dá)及其上游信號(hào)通路，觀察內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白o(hù)ccludin蛋白表達(dá)的情況。方法：取培養(yǎng)后傳代3-4代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，分組如下(8組)：空白組，BSA組，AGEs組，米諾環(huán)素+AGEs組，GM6001+AGEs組，AG490+AGEs組，VEGF抗體+AGEs組，抗氧化

2、劑+AGEs組。孵育48h后，收集各組細(xì)胞，RT-PCR方法檢測(cè)各組MMP9基因表達(dá)；對(duì)AGEs組，BSA組，米諾環(huán)素+AGEs組，以及GM6001+AGEs等4組，采用Western Blot方法檢測(cè)其MMP9，以及occludin蛋白表達(dá)情況，并且用細(xì)胞免疫熒光法觀察occludin在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果：各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均有MMP9的基因表達(dá)，經(jīng)過(guò)AGEs處理后的內(nèi)皮細(xì)胞其MMP9表達(dá)明顯升高(P<0.01)，而在AGEs處理

3、同時(shí)給予抗氧化劑，VEGF抗體，GM6001，以及米諾環(huán)素處理后，其MMP9的表達(dá)下降，與AGEs處理組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。經(jīng)AGEs處理后內(nèi)皮細(xì)胞MMP9蛋白表達(dá)亦升高(p<0.05)，同時(shí)，occludin蛋白表達(dá)下調(diào)(p<0.05)，而經(jīng)過(guò)GM6001以及米諾環(huán)素處理后，內(nèi)皮細(xì)胞的MMP9蛋白表達(dá)異常升高受到抑制，同時(shí)occludin蛋白表達(dá)異常下調(diào)得到改善，內(nèi)皮細(xì)胞間的連接形態(tài)改善。結(jié)論：AGEs能通過(guò)上調(diào)MMP9的表

4、達(dá)破壞內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin，這個(gè)過(guò)程與氧化應(yīng)激，VEGF等因素有密切關(guān)系，這可能是糖尿病性視網(wǎng)膜病變血視網(wǎng)膜屏障破壞的重要原因：MMP9的抑制劑GM6001以及米諾環(huán)素能抑制這個(gè)病理過(guò)程，改善內(nèi)皮細(xì)胞的連接狀態(tài)。 動(dòng)物試驗(yàn)部分：I：基質(zhì)金屬蛋白酶9在糖基化終產(chǎn)物所致的大鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏中作用研究 目的：在體研究基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)在糖基化終產(chǎn)物所致的血-視網(wǎng)膜屏障損害中的作用，評(píng)估米諾環(huán)素對(duì)A

5、GEs所致的血-視網(wǎng)膜屏障損害的治療作用。方法：48只SD大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(n=16)，AGEs-BSA組(n=16)和AGEs-BSA+米諾環(huán)素組(n=16)。對(duì)照組和AGEs-BSA組分別自尾靜脈注入對(duì)照物BSA和AGEs-BSA，每天一次，每次40mg/kg，AGEs-BSA+米諾環(huán)素組在每天注入AGEs-BSA的同時(shí)隔日腹腔注射米諾環(huán)素45mg/kg。14天后，每組取6只大鼠用伊文斯蘭法觀察并比較各組視網(wǎng)膜血管通透性，其

6、余大鼠處死后，采用RT-PCR、WESTERN BLOT法觀察視網(wǎng)膜MMP9的表達(dá)。結(jié)果：AGEs-BAS組MMP9mRNA和蛋白水平均較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，同時(shí)，網(wǎng)膜微血管滲透性也顯著升高(P<0.01)。而在AGEs-BSA處理同時(shí)給予米諾環(huán)素的大鼠視網(wǎng)膜基因和蛋白水平的MMP9均被抑制(P<0.01)，同時(shí)網(wǎng)膜微血管滲漏被部分逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。視網(wǎng)膜微血管滲透性與MMP9蛋白表達(dá)間存在正相關(guān)(R=0.8916，P<

7、0.01)。結(jié)論：AGEs所致的視網(wǎng)膜微血管滲漏與MMP9的高表達(dá)有密切關(guān)系，AGEs的作用至少部分是通過(guò)MMP9實(shí)現(xiàn)。米諾環(huán)素能部分逆轉(zhuǎn)AGEs-MMP9途徑所致的血管滲漏。 動(dòng)物試驗(yàn)II：米諾環(huán)素對(duì)糖尿病性大鼠視網(wǎng)膜電圖異常和血管滲漏治療作用的初步觀察 目的：觀察米諾環(huán)素對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜電圖和血管滲透性的影響。方法：40只SD大鼠，用STZ法建立糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型，建模成功后34只，其中24只以米諾

8、環(huán)素灌胃，按給藥濃度不同建立試驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2，剩余10只作為糖尿病視網(wǎng)膜病變組(DM組)，健康相當(dāng)體重SD大鼠10只作為正常對(duì)照(CON組)。實(shí)驗(yàn)組1(T1組)和試驗(yàn)組2(T2組)分別給予2.5mg/kg，5mg/kg濃度的米諾環(huán)素，每日一次灌胃，連續(xù)兩個(gè)月后，用視覺(jué)電生理儀測(cè)定各組大鼠ERG b波和OPs，并且用伊文思蘭法測(cè)定大鼠視網(wǎng)膜血管滲透性。HE切片觀察各組視網(wǎng)膜形態(tài)。四組間進(jìn)行比較分析。結(jié)果：糖尿病視網(wǎng)膜大鼠其視網(wǎng)膜電圖b波