ILK在糖尿病視網(wǎng)膜病變中作用的研究.pdf

1、研究背景: 糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病患者最重要的微血管并發(fā)癥之一，也是成人主要的致盲眼病，其早期特征是視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的凋亡，血管滲透性增加，進(jìn)行性的血管閉塞，然而引起這些改變的詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚。 血視網(wǎng)膜內(nèi)屏障是由視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、覆蓋內(nèi)皮細(xì)胞的周細(xì)胞及基底膜所構(gòu)成。iBRB的完整性是由緊密連接和黏附連接構(gòu)成密封的連接復(fù)合體所決定，另外一個決定因素是肌動蛋白細(xì)胞骨架。 細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附連

2、接主要由鈣粘蛋白和通過構(gòu)象改變來完成結(jié)構(gòu)和信號分子激活的整合蛋白所介導(dǎo)。在視網(wǎng)膜，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞之間同源性黏附連接的cadherin主要是VE-cadherin和N-cadherin，形成局部黏附。而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間異源性黏附主要是N-cadherin，形成特殊的釘鉚結(jié)構(gòu)的黏附連接。 N-Cadherin通過β-連環(huán)蛋白連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架。而內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞與ECM的連接主要是整合蛋白所介導(dǎo)。 整合蛋白介導(dǎo)細(xì)胞

3、黏附經(jīng)信號分子募集到局部黏附來調(diào)控大量生物學(xué)過程，包括調(diào)控細(xì)胞生長、移動、分化、凋亡、細(xì)胞生存以及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。一個在整合蛋白激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的激酶是整合蛋白連接激酶。ILK是細(xì)胞內(nèi)包含絲氨酸-蘇氨酸激酶的錨蛋白重復(fù)序列，與β1,β3-整合蛋白相互作用，作為細(xì)胞反應(yīng)整合蛋白和生長因子所介導(dǎo)的信號的關(guān)鍵調(diào)控子調(diào)控整合蛋白依賴的功能。ILK涉及細(xì)胞骨架的構(gòu)成、細(xì)胞增殖、生存和凋亡以及ECM的聚集。ILK連接整合蛋白到肌動蛋白

4、細(xì)胞骨架，轉(zhuǎn)導(dǎo)從整合蛋白到細(xì)胞外基質(zhì)和各種亞細(xì)胞成分的信號以及從細(xì)胞外環(huán)境到細(xì)胞內(nèi)的信號。同樣，ILK調(diào)控一些信號中間媒介活性，包括Akt/FOXO、GSK-3β、ERK、β-catenin和cadherin。 然而目前還沒有關(guān)于ILK 及其相關(guān)信號分子在糖尿病視網(wǎng)膜病變中生物學(xué)功能的研究。本研究的目的是證明ILK 以及FOXO1A、N-cadherin 和β-catenin 在鏈唑霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜

5、微血管周細(xì)胞的表達(dá)及其在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展的影響作用，闡明ILK 對糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的可能的調(diào)控作用，進(jìn)一步探索預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病變的線索，開辟治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新途徑。 目的: 1.本研究通過分析ILK在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜微血管中的活性和表達(dá)，證明ILK是否涉及糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)理。 2.通過研究N-cadherin，β-catenin和FOXO1A在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜

6、微血管中的表達(dá)，證明其是否影響糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。 3.通過研究ILK和FOXO1A在高糖條件下培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞的表達(dá)證明ILK和FOXO1A是否涉及高糖誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡。 方法: 該課題研究通過建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型和原代培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞，采用伊文思藍(lán)的方法測量對照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4w、8w和12w視網(wǎng)膜微血管滲透性，半定量RT-PCR檢測對照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4

7、w、8w和12w視網(wǎng)膜ILK mRNA水平，免疫組化檢測對照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12w視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜微血管ILK、N-cadherin、β-catenin和FOXO1A的免疫反應(yīng)性，進(jìn)一步采用Western blot方法檢測對照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4w、8w和12w視網(wǎng)膜ILK、N-cadherin、β-catenin、Akt和FOXO1A的蛋白水質(zhì)表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測高糖條件下培養(yǎng)72h的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞ILK和

8、FOXO1A免疫染色，Annexin V-FITC流式細(xì)胞儀檢測高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞凋亡水平。Western blot方法檢測高糖條件下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞ILK和FOXO1A的蛋白質(zhì)水平。 結(jié)果: 1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重與對照組相比顯著減輕(P<0.005)，12 w糖尿病大鼠體重236 ± 14.1 g，而對照組大鼠體重為496 ± 10.2 g。同時，STZ誘導(dǎo)的糖

9、尿病大鼠血糖水平與對照組相比顯著升高(P <0.005)，糖尿病誘導(dǎo)后12 w血糖為30.2 ± 4.8 mmol/L，對照組血糖為4.9 ± 0.12 mmol/L。 2.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4 w、8 w和12 w后，視網(wǎng)膜血管滲透性與對照組相比分別增加68％、91％和125％ (P <0.005)。 3.半定量RT-PCR結(jié)果分析表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4 w、8 w和12 w后，視網(wǎng)膜ILKmRNA水平與

10、對照組相比分別增加12.2％、35.8％和45.6％ (P<0.05)。 4.免疫組織化學(xué)結(jié)果分析表明，視網(wǎng)膜ILK免疫染色主要分布在OPL、INL、IPL、GCL及視網(wǎng)膜微血管包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，而STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12 w后，ILK免疫反應(yīng)性顯著增加。同樣FOXO1A免疫染色主要分布在OPL、INL、IPL、GCL及視網(wǎng)膜微血管包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，而STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12 w后，F(xiàn)OXO1A免疫反應(yīng)性顯著增加；

11、β-catenin的免疫染色主要分布在大鼠視網(wǎng)膜PL、OPL、IPL、GCL、ILM及視網(wǎng)膜微血管包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，而STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12 w后，β-catenin的免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)；N-cadherin的免疫染色主要分布在視網(wǎng)膜OPL、INL、IPL、GCL、ILM及視網(wǎng)膜微血管包括內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，但是STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12 w后，N-cadherin的免疫反應(yīng)性顯著減少。 5.Western blot 結(jié)

12、果分析表明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4 w、8 w 和12 w后，視網(wǎng)膜ILK 蛋白質(zhì)水平與對照組相比分別增加35.6％、77.6％ 和89.8％( P <0.05)，同樣β-catenin 蛋白質(zhì)表達(dá)水平與對照組相比分別增加13.2％、15.8％和35.1％(P <0.05)，而N-cadherin 蛋白質(zhì)水平與對照組相比分別減少15.4％、28.37％和37.2％(P <0.05)；與此同時STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠8 w 和12 w

13、后，視網(wǎng)膜Akt 蛋白質(zhì)水平與對照組相比分別減少15.2％ 和22.1％( P <0.05)，磷酸化Akt-473 和Akt-308 蛋白質(zhì)水平分別減少38.5％、65.4％ 和8.8％、63.4％( P <0.05)，同樣FOXO1A 和磷酸化FOXO1A 蛋白質(zhì)水平分別增加20.2％、41.6％(P <0.05)和減少5.8％、25.8％(P <0.05)；而在糖尿病大鼠誘導(dǎo)后4 w，視網(wǎng)膜Akt 蛋白質(zhì)水平增加20.6％ (P <

14、0.05)，磷酸化Akt-473 和Akt-308 蛋白質(zhì)水平分別增加136.6％ 和64.8％( P <0.05)，而視網(wǎng)膜FOXO1A和磷酸化FOXO1A 蛋白質(zhì)水平分別減少23.2％(P <0.05)和增加55.8％(P <0.05)。 6.免疫細(xì)胞化學(xué)發(fā)現(xiàn)牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞在5mmol/L D-葡萄糖條件下培養(yǎng)72 h后未發(fā)現(xiàn)ILK免疫染色，而FOXO1A免疫染色主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；在30 mmol/L D-葡

15、萄糖或5μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)72 h后，周細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，ILK免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)，免疫染色主要分布在細(xì)胞質(zhì)，同樣FOXO1A免疫反應(yīng)性顯著增加，F(xiàn)OXO1A免疫染色主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。 7.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞在30 mmol/L 高糖條件下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h 后凋亡與對照組相比分別增加47.6％、58.4％和68.7％( P <0.05)具有時間依賴性。 8.Western

16、blot 檢測發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞在30 mmol/L D-葡萄糖條件下培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h， ILK 的蛋白質(zhì)水平與對照組相比分別增加27.2％、48.6％ 和54.5％( P <0.05)，對照組和甘露醇組無顯著差別；周細(xì)胞在高糖條件下培養(yǎng)24 h， FOXO1A 和p-FOXO1A 的蛋白質(zhì)水平與對照組相比分別減少17％和增加40％ (P <0.05)，培養(yǎng)48 h 和72 h 后FOXO1A 和p-FOXO1A 的蛋白質(zhì)水平

17、與對照組相比分別增加45％、51％(P <0.05)和減少44％、63％ (P<0.05)。而甘露醇組與對照組無顯著差別。 結(jié)論: 1.本研究首次證明STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜微血管ILKmRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，表明ILK 可能參與早期糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)和血管組織的損害以及糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。 2.本研究首次證明STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及其微血管N-cadherin表達(dá)下調(diào)，而β-cat