人牙齦成纖維細(xì)胞復(fù)合不同配比的殼聚糖-明膠-卡拉膠支架的體外研究.pdf

1、目的:
　　 研究人牙齦成纖維細(xì)胞(humangingivalfibroblasts，HGFs)與不同配比的殼聚糖/明膠/卡拉膠牙齦組織工程支架材料復(fù)合后的生長增殖情況及其分泌Ⅰ型膠原(TypeⅠCollagen，ColⅠ)和結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的情況，篩選出最適合HGFs生長的殼聚糖/明膠/卡拉膠支架材料。初步探討CTGF對HGFs在該支架微環(huán)境下分泌ColⅠ的

2、影響，為研究牙齦組織工程支架材料提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.HGFs的原代培養(yǎng)、傳代及來源鑒定
　　 采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)HGFs，酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，抗角蛋白染色及波形絲蛋白染色進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定。
　　 2.HGFs與不同配比的殼聚糖/明膠/卡拉膠支架復(fù)合培養(yǎng)
　　 (1)采用改良乳化冷凝聚合法制備不同配比的殼聚糖/明膠/卡拉膠支架。實(shí)驗(yàn)分四組，實(shí)驗(yàn)組一:5％卡拉膠+殼聚糖+明

3、膠;實(shí)驗(yàn)組二:10％卡拉膠+殼聚糖+明膠;實(shí)驗(yàn)組三:15％卡拉膠+殼聚糖+明膠;對照組:殼聚糖+明膠。（每組殼聚糖、明膠的比例均為1∶1）
　　 (2)將HGFs接種于四組支架材料后，在培養(yǎng)的1、3、5、7天時(shí)MTT法檢測HGFs在四組支架材料上的增殖情況，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssays，ELISA)法檢測HGFs在四組支架材料上ColⅠ和CTGF的分泌情況。在復(fù)合培養(yǎng)的第7天

4、掃描電子顯微鏡(ScanningElectronicMicroscope，SEM)和顯微CT(Micro-CT)觀察支架形態(tài)以及細(xì)胞在支架上的生長情況。篩選出最適合HGFs生長的殼聚糖/明膠/卡拉膠支架材料。
　　 3.相同方法以及條件將HGFs分別接種于上述實(shí)驗(yàn)篩選出的支架材料上進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中加入anti-CTGF抗體（對照組為不含anti-CTGF抗體的培養(yǎng)基），在培養(yǎng)1、3、5、7天時(shí)ELISA法檢測細(xì)胞上清

5、液中ColⅠ和CTGF的濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出原代HGFs。倒置相差顯微鏡下見5～7天后即有細(xì)胞從組織塊周圍游出，細(xì)胞呈長梭形，放射狀排列。15～20天細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90％左右。傳代后細(xì)胞呈長梭形，胞核圓，核仁清晰。免疫組化染色波形蛋白抗體體陽性，抗角蛋白抗體陰性。
　　 2.SEM結(jié)果顯示支架孔徑在50-200μm之間，SEM和Micro-CT結(jié)果均示各組支架材料具有良好的

6、孔隙率和互相連通的孔徑結(jié)構(gòu)。
　　 3.MTT法檢測HGFs的增殖活性顯示:細(xì)胞培養(yǎng)第1天對照組OD值大于實(shí)驗(yàn)組;第3、5、7天實(shí)驗(yàn)組OD值大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且實(shí)驗(yàn)組一OD值大于其余實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.ELISA法檢測上清液中ColⅠ和CTGF含量結(jié)果顯示:細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)第1、3、5、7天實(shí)驗(yàn)組分泌ColⅠ的濃度大于對照組，且實(shí)驗(yàn)組一大于其余實(shí)驗(yàn)組，差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;第1、3、5、7天對照組CTGF的濃度小于實(shí)驗(yàn)組，第3、5、7天時(shí)實(shí)驗(yàn)組一大于其余實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)合培養(yǎng)第1、3、5、7天，隨著時(shí)間的增加，對照組、實(shí)驗(yàn)組一、實(shí)驗(yàn)組二細(xì)胞上清液中ColⅠ的濃度增加，同時(shí)CTGF的濃度也增加。
　　 5.ELISA法檢測上清液中ColⅠ和CTGF濃度結(jié)果顯示:加入anti-CTGF抗體的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞上清液的ColⅠ和CTGF的濃度均小于未加a

8、nti-CTGF抗體的對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.組織塊細(xì)胞培養(yǎng)法是原代培養(yǎng)HGFs的傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，是后期實(shí)驗(yàn)成功的前提和基礎(chǔ)。
　　 2.本研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖/明膠/卡拉膠支架（5％卡拉膠+殼聚糖+明膠）與對照組和其余實(shí)驗(yàn)組支架相比，有利于HGFs的生長和繁殖，其生物學(xué)行為更加活躍，更適合作為組織工程化牙齦的生物支架材料。
　　 3.CTGF在殼聚糖/明膠/卡拉膠支