κ-卡拉膠酶基因克隆表達及酶法制備卡拉膠低聚糖工藝研究.pdf

1、κ-卡拉膠是存在于海洋紅藻細胞壁中的一種結構性多糖,大量研究證實,κ-卡拉膠寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤、抗HIV、免疫調節(jié)等多種生理活性,具有較高的藥用開發(fā)價值。毋庸置疑,酶解法具有特異性強、產物單一、反應條件溫和等特點,因此,酶解法制備κ-卡拉膠寡糖是一種理想手段。但自然界分離得到的κ-卡拉膠酶產生菌酶產量較低無法滿足生產需求。酶基因工程技術的發(fā)展為酶的定向改造提供了條件,拓展了酶的研究空間。本文采用基因工程技術對細菌來源的κ-

2、卡拉膠酶基因進行異源分泌表達,以期實現(xiàn)酶產量的大幅提升,進一步拓寬酶的應用范圍。研究結果如下:
　　(1)經16s rDNA鑒定,野生的κ-卡拉膠酶產生菌屬于 Zobellia屬并命名為Zobellia sp. ZM-2。應用 Primer-Blast設計了三對引物 FP1/RP1、 FP2/RP2、FP3/RP3擴增κ-卡拉膠酶基因,結果顯示,采用引物對FP2/RP2可以擴增出單一的目的條帶。所得κ-卡拉膠酶基因的ORF長度為1

3、638bp,編碼545aa,其中N-端的29aa為信號肽序列,基因所編碼的氨基酸序列與現(xiàn)有序列的最大相似度為86％,可以確定為一種新的κ-卡拉膠酶基因,并命名為 cgkZ。進一步比對分析發(fā)現(xiàn),該酶具有 GH16糖苷水解酶家族共有的催化結構E(I/L/V)D(I/V/A/F)(V/I/L/M/F)(0,1)E,說明該κ-卡拉膠酶也屬于GH16糖苷水解酶家族。
　　(2)在獲得cgkZ基因全序列的基礎上,設計了帶有限制性酶切位點Bam

4、H1和XhoI的引物,用來擴增包含有信號肽序列(cgkZ)和不帶有信號肽序列(cgkZˉ)的卡拉膠酶基因。然后構建重組質粒pProEX-HTa-cgkZ及pProEX-HTa-cgkZˉ,轉化大腸桿菌 BL21(DE3)進行異源表達。結果發(fā)現(xiàn),帶有信號肽的重組菌BL21-HTa-cgkZ在保證胞內酶活力與不帶信號肽的重組菌 BL21-HTa-cgkZˉ基本相同的前提下,能將重組酶較多的分泌到胞外。為了使酶的產`量得到進一步提升,對重組菌

5、 BL21-HTa-cgkZ的胞外產酶條件進行了一系列的優(yōu)化,確定了最佳的誘導條件(誘導溫度23℃,IPTG濃度0.9 mM,誘導時機2.5 h)和培養(yǎng)條件(接種量1%,培養(yǎng)基pH5.5)。同時,培養(yǎng)基中添加0.5%乳糖或誘導后2h添加0.1% TritonX-100或0.5% Gly有利于胞外酶的進一步釋放。生長產酶曲線表明,使用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的條件下,胞外酶活力最大可達9.37 U/mL,最大周質空間酶活為6.06 U/mL。綜

6、合來看,約51%的卡拉膠酶被分泌到胞外,33%的酶積累中周質空間中,遠大于野生菌κ-卡拉膠酶的產量0.33 U/mL,從而實現(xiàn)了κ-卡拉膠酶產量的大幅提升。
　　(3)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),重組酶的分子量為45 kDa,小于根據(jù)基因序列推定的分子量61.9 kDa,推測可能存在一翻譯后加工過程切除了部分片段。His-Tag的存在方便了蛋白純化,采用Ni-瓊脂糖親和純化的方法可得到較純的重組蛋白。酶學性質的研究表明,重組酶的最適

7、反應溫度為39℃,40℃條件下保存1h酶活力損失50%,在35℃保存3 h酶活力沒有明顯損失。重組酶的最適pH為6.0,在pH6.0~7.0條件下保存2 h酶活力無明顯損失。Na+、Tween-80、TritonX-100、DTT對重組κ-卡拉膠酶活力有明顯的促進作用;Cu2+、Pb2+、EDTA對酶活力有明顯的抑制作用,5mM Cu2+存在條件下可以使酶活力損失73.4%。ESI-MS分析降解后的卡拉膠寡糖發(fā)現(xiàn),酶解產物中包含特征性的

8、κ-卡拉膠四糖[A-G4s]2,六糖[A-G4s]3,八糖[A-G4s]4的電荷峰,其中六糖的電荷峰數(shù)量較多。紅外分析結果顯示寡糖的紅外譜圖中包含有848 cm-1,929 cm-1的強吸收峰,分別為κ-卡拉膠基本結構組成糖單元的特征吸收峰,進一步驗證了所得卡拉膠寡糖為κ-型的卡拉膠寡糖。
　　(4)以耳突麒麟菜替代κ-卡拉膠為原料制備κ-卡拉膠寡糖。通過單因素實驗確定了纖維素酶的作用條件:纖維素酶添加量2.1萬U/g麒麟菜,酶解