純鈦表面不同處理對人牙齦成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：種植體頸部軟組織附著形成的“袖口”結(jié)構(gòu)，可以形成良好的生物封閉屏障，有效阻止細(xì)菌及其他致炎因子的入侵，減少種植術(shù)后骨吸收，是維持種植體長期穩(wěn)定性的重要因素之一。合理的種植體頸部處理應(yīng)該有利于種植體頸部牙齦附著-袖口的形成。本實(shí)驗旨在通過比較三種不同處理方法純鈦表面對體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞粘附及增殖的影響，探討更有利于人牙齦成纖維附著的種植體頸部表面處理方法，為臨床種植體頸部改良設(shè)計的提供有力的實(shí)驗依據(jù)。
　　 方法：<

2、br>　　 1.純鈦片的制備與分組制備直徑10mm、厚度1mm，Ra0.8μm的純鈦鈦片24枚，分為3組，每組8枚。
　　 A組（TiO2顆粒噴砂+HCl/H2SO4雙重酸蝕組）：80目TiO2砂粒在5Kpa氣壓下均勻噴到純鈦鈦片表面進(jìn)行表面粗化，HCl/H2SO4雙重酸蝕處理。
　　 B組（Al2O3顆粒噴砂+HCl/H2SO4雙重酸蝕組）：80目Al2O3砂粒在5Kpa氣壓下均勻噴到純鈦鈦片表面進(jìn)行表面粗化，HCl

3、/H2SO4雙重酸蝕處理。
　　 C組（光滑組）：鈦片表面不做任何處理。
　　 2.不同處理純鈦表面形貌的掃描電鏡觀察清洗干凈、高溫消毒后的每組鈦片1枚，掃描電子顯微鏡觀察鈦片表面形貌。
　　 3.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定取臨床阻生齒拔除術(shù)切除的牙齦組織，要求為無炎癥、無增生的健康牙齦，患者年齡在18-25歲。采用組織塊貼壁法進(jìn)行人牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，通過反復(fù)貼壁法去除原代培養(yǎng)中混雜的上皮樣細(xì)胞，得到純

4、化人牙齦成纖維細(xì)胞。HE染色觀察純化后第4代人牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)；應(yīng)用波形蛋白(Vimentin)、角蛋白(CKs)及α橫紋肌肌動蛋白(α-Actin)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源。
　　 4.不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)取第4代生長良好的人牙齦成纖維細(xì)胞，制備成細(xì)胞濃度為4.0×105個/ml的單細(xì)胞懸液，分別接種于三組不同處理的純鈦表面以及作為對照的玻片表面進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，取各組純鈦片進(jìn)行MTT檢測，

5、培養(yǎng)3天后進(jìn)行掃描電鏡觀察。
　　 5.不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)及分布掃描電鏡觀察培養(yǎng)三天后經(jīng)掃描電子顯微鏡(scanning electronmicroscopy，SEM)觀察不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)及分布。
　　 6.不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞增殖活性MTT檢測培養(yǎng)24小時后應(yīng)用MTT法測量三組（每組6枚）不同處理純鈦表面的吸光度值，計算各組吸光度均值（以(-χ)±SD表示）進(jìn)行統(tǒng)計

6、學(xué)分析。
　　 7.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，若實(shí)驗數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，并應(yīng)用SNK進(jìn)行組間的兩兩比較。若不滿足正態(tài)分布或方差齊性則應(yīng)用多個獨(dú)立樣本比較的K-WH檢驗，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且采用Wilcoxon秩和檢驗進(jìn)行組間的兩兩比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同處理純鈦表面形貌的掃描電鏡觀察結(jié)果TiO

7、2顆粒噴砂雙重酸洗處理與Al2O3顆粒噴砂雙重酸蝕處理的純鈦表面形貌相似，均形成大小不一，凹凸不平的一級窩洞及二級窩洞，窩洞邊緣較為圓鈍。未經(jīng)處理的純鈦表面相對光滑，可見蜂窩狀淺表窩洞。
　　 2.人牙齦成纖維細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察原代細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀排列生長，細(xì)胞呈長梭形或多角形，胞體豐滿，胞漿均勻透明，核仁清晰。傳代細(xì)胞生長旺盛，與原代形態(tài)相同。HE染色顯示細(xì)胞呈長梭形或多角形，橢圓形胞核位于細(xì)胞中央，內(nèi)含2-

8、3個核仁。細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示細(xì)胞抗波形蛋白染色呈強(qiáng)陽性，胞漿棕褐色；抗角蛋白染色陰性及抗α橫紋肌肌動蛋白染色陰性，胞漿陰性，胞核染成藍(lán)色。證明細(xì)胞來源于中胚層，且非上皮源性及肌源性細(xì)胞，符合成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的特征，體外成功培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞。
　　 3.不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)及分布掃描電鏡觀察噴砂粗化雙重酸蝕處理的兩組純鈦表面細(xì)胞較表面不做處理的光滑鈦片表面細(xì)胞更為密集。噴砂粗化雙重酸蝕處理的兩組純鈦

9、表面細(xì)胞胞體豐滿，伸展良好，伸出偽足多而長，伸入周邊凹孔內(nèi)，細(xì)胞固定牢固，有的細(xì)胞之間偽足可交織成網(wǎng)狀，粗糙表面布滿細(xì)胞外基質(zhì)。而表面不作處理光滑組純鈦表面附著的細(xì)胞較粗糙的兩組伸展較差，有的細(xì)胞近似圓形，偽足少且較短，細(xì)胞外基質(zhì)分泌較少。在光滑的玻片上細(xì)胞扁平，呈長梭形，可見細(xì)絲狀偽足伸展。
　　 4.不同處理純鈦表面人牙齦成纖維細(xì)胞生長活性MTT檢測培養(yǎng)24小時各組吸光度均值（以(-χ)±SD表示），A組（TiO2顆粒噴砂+

10、HCl/H2SO4雙重酸蝕組）為1.122±0.026，B組（Al2O3顆粒噴砂+HCl/H2SO4雙重酸蝕組）為0.772±0.079，C組（表面不做處理的光滑組）為0.305±0.035。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。SNK檢驗進(jìn)行組間的兩兩比較，A組與B組，A組與C組，B組與C組之間均有差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.三種不同表面處理的純鈦片都具有良好的生物學(xué)性能，人牙