APC基因甲基化與人宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)性研究.pdf

1、目的：檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（HPV18型）、CaSki和SiHa（HPV16型）中結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因5'端啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探索APC基因表達(dá)沉默是否與其啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化有關(guān)，觀察肼苯噠嗪(Hydralazine)能否作為去甲基化藥物誘導(dǎo)APC基因表達(dá)，并進(jìn)一步探討肼苯噠嗪對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，為宮頸癌的診斷及去甲基化治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)利用甲基化特異性PCR（Methyl

2、ation specific PCR, MSP）檢測(cè)人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki和SiHa中APC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。(2)不同濃度肼苯噠嗪處理上述三種宮頸癌細(xì)胞及正常細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HECV，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。(3)MSP法檢測(cè)肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細(xì)胞中APC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）及熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測(cè)肼苯噠嗪對(duì)APC m

3、RNA表達(dá)的影響；(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肼苯噠嗪對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，免疫組化SP法檢測(cè)肼苯噠嗪對(duì)APC相關(guān)蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin,β-cat）表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)MSP檢測(cè)結(jié)果表明HeLa細(xì)胞系A(chǔ)PC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島甲基化，CaSki細(xì)胞系A(chǔ)PC基因?yàn)榘爰谆?，SiHa細(xì)胞系A(chǔ)PC基因無(wú)甲基化。(2) 5、10、20、40、80、160和320 μmol/L 肼苯噠嗪分別處理三種宮頸癌細(xì)胞

4、系及正常細(xì)胞HECV，MTT法檢測(cè)到20 μmol/L以上肼苯噠嗪處理72 h后，三種宮頸癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)均可被抑制，且抑制率隨時(shí)間及藥物濃度的增加而逐漸升高；當(dāng)40 μmol/L肼苯噠嗪處理72 h后，HeLa、CaSki和SiHa細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制率分別為(52.12±3.78) ％、(44.31±2.59) ％、(47.73±4.73) ％，而同樣情況下，正常細(xì)胞HECV表現(xiàn)為耐藥，抑制率只有(27.18±0.79) ％。 (3) M

5、SP法檢測(cè)40 μmol/L肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細(xì)胞中APC基因甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)APC基因啟動(dòng)子呈去甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)APC mRNA在HeLa和CaSki細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)Q-PCR法觀察到肼苯噠嗪處理HeLa、CaSki和SiHa三種細(xì)胞后，APC mRNA表達(dá)分別是處理前的10.35倍、11.40倍及0.73倍。（4）流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)：40 μmol/L 肼苯噠嗪作用HeLa、CaSki細(xì)胞72

6、h后，細(xì)胞周期的G0/G1期均顯著減少，細(xì)胞被阻滯于S期和G2/M期，且凋亡率與對(duì)照組比較均顯著增多（P<0.01）；SP法檢測(cè)到40 μmol/L肼苯噠嗪處理HeLa和CaSki細(xì)胞72 h后，β-cat蛋白可恢復(fù)在細(xì)胞膜上的表達(dá)。 結(jié)論：(1)兩種不同HPV型別的 HeLa和CaSki細(xì)胞中APC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)均存在CpG島甲基化，APC基因甲基化在人宮頸癌癌變過(guò)程中可能是一種比較重要的分子調(diào)控機(jī)制。和CaSki同為HP

7、V16型的SiHa細(xì)胞中APC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)無(wú)CpG島甲基化，表明人宮頸癌細(xì)胞的HPV型別和APC基因5'端啟動(dòng)子區(qū)CpG島是否甲基化無(wú)相關(guān)性。(2)肼苯噠嗪能作為去甲基化藥物誘導(dǎo)因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化而表達(dá)沉默或減少的APC基因表達(dá)呈陽(yáng)性或者表達(dá)增強(qiáng)。(3)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的機(jī)制不是單一的使APC 基因去甲基化。(4)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細(xì)胞系生長(zhǎng)的主要原因是將細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，同時(shí)使凋亡增多。(5)肼苯噠嗪