APC基因甲基化與人宮頸癌細胞增殖及凋亡相關性研究.pdf

1、目的：檢測人宮頸癌細胞系HeLa（HPV18型）、CaSki和SiHa（HPV16型）中結腸腺瘤性息肉病(APC)基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，探索APC基因表達沉默是否與其啟動子區(qū)CpG島甲基化有關，觀察肼苯噠嗪(Hydralazine)能否作為去甲基化藥物誘導APC基因表達，并進一步探討肼苯噠嗪對宮頸癌細胞的生長抑制作用，為宮頸癌的診斷及去甲基化治療提供新的實驗依據。 方法：(1)利用甲基化特異性PCR（Methyl

2、ation specific PCR, MSP）檢測人宮頸癌細胞系HeLa、CaSki和SiHa中APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。(2)不同濃度肼苯噠嗪處理上述三種宮頸癌細胞及正常細胞人臍靜脈內皮細胞HECV，MTT法檢測各組細胞生長情況。(3)MSP法檢測肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)；反轉錄PCR（RT-PCR）及熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測肼苯噠嗪對APC m

3、RNA表達的影響；(4)流式細胞術檢測肼苯噠嗪對細胞周期和細胞凋亡的影響，免疫組化SP法檢測肼苯噠嗪對APC相關蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin,β-cat）表達的影響。 結果：(1)MSP檢測結果表明HeLa細胞系APC基因5'端啟動子區(qū)存在CpG島甲基化，CaSki細胞系APC基因為半甲基化，SiHa細胞系APC基因無甲基化。(2) 5、10、20、40、80、160和320 μmol/L 肼苯噠嗪分別處理三種宮頸癌細胞

4、系及正常細胞HECV，MTT法檢測到20 μmol/L以上肼苯噠嗪處理72 h后，三種宮頸癌細胞系的生長均可被抑制，且抑制率隨時間及藥物濃度的增加而逐漸升高；當40 μmol/L肼苯噠嗪處理72 h后，HeLa、CaSki和SiHa細胞系的生長抑制率分別為(52.12±3.78) ％、(44.31±2.59) ％、(47.73±4.73) ％，而同樣情況下，正常細胞HECV表現(xiàn)為耐藥，抑制率只有(27.18±0.79) ％。 (3) M

5、SP法檢測40 μmol/L肼苯噠嗪處理后HeLa和CaSki細胞中APC基因甲基化狀況，發(fā)現(xiàn)APC基因啟動子呈去甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)APC mRNA在HeLa和CaSki細胞中均呈陽性表達，F(xiàn)Q-PCR法觀察到肼苯噠嗪處理HeLa、CaSki和SiHa三種細胞后，APC mRNA表達分別是處理前的10.35倍、11.40倍及0.73倍。（4）流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)：40 μmol/L 肼苯噠嗪作用HeLa、CaSki細胞72

6、h后，細胞周期的G0/G1期均顯著減少，細胞被阻滯于S期和G2/M期，且凋亡率與對照組比較均顯著增多（P<0.01）；SP法檢測到40 μmol/L肼苯噠嗪處理HeLa和CaSki細胞72 h后，β-cat蛋白可恢復在細胞膜上的表達。 結論：(1)兩種不同HPV型別的 HeLa和CaSki細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)均存在CpG島甲基化，APC基因甲基化在人宮頸癌癌變過程中可能是一種比較重要的分子調控機制。和CaSki同為HP

7、V16型的SiHa細胞中APC基因5'端啟動子區(qū)無CpG島甲基化，表明人宮頸癌細胞的HPV型別和APC基因5'端啟動子區(qū)CpG島是否甲基化無相關性。(2)肼苯噠嗪能作為去甲基化藥物誘導因啟動子區(qū)CpG島甲基化而表達沉默或減少的APC基因表達呈陽性或者表達增強。(3)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細胞系生長的機制不是單一的使APC 基因去甲基化。(4)肼苯噠嗪抑制宮頸癌細胞系生長的主要原因是將細胞阻滯于S期和G2/M期，同時使凋亡增多。(5)肼苯噠嗪