激活外周ephrinBs-EphBs信號(hào)引起的痛覺過敏及其機(jī)制研究.pdf

1、目的: EphBs受體及ephrinBs配體存在于成年的大腦及外周組織中，在各種病理、生理性疼痛中具有重要作用。我們及其他實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)證明脊髓水平ephrinBs/EphBs信號(hào)參與了傷害性信息的調(diào)制及中樞敏化。然而，ephrinBs/EphBs信號(hào)在外周敏化中的作用尚不清楚。本研究的同的是探討外周ephrinBs/EphBs受體信號(hào)在痛覺過敏中的作用及其機(jī)制。 方法: 1.為觀察外周注射EphrinB1-Fc是否引

2、起劑量依賴性的痛覺過敏，足底注射不同劑量的ephrinB1-Fc(0.02，0.1，0.5-ug，溶于10ul生理鹽水中)；為觀察EphrinB1-Fc的效應(yīng)是否由EphB受體介導(dǎo)，EphB1-Fc(0.5-ug)在注射ephrinB1-Fc(0.5-ug)30分鐘前給予，然后觀察EphrinB1-Fc注射后30分鐘內(nèi)小鼠自發(fā)痛行為，注射后30分鐘，1，2，4，8，24，48小時(shí)熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方

3、法檢測ephrinB1-Fc(0.5-ug)注射1小時(shí)后脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)。 2.為觀察外周注射EphrinB1-Fc是否劑量依賴性激活皮膚磷酸化MAPKs，足底注射不同劑量的ephrinB1-Fc(0.02，0.1，0.5-ug)；為觀察外周注射EphrinB1-Fc引起皮膚磷酸化MAPKs激活的時(shí)間依賴性，足底注射ephrinB1-Fc(0.5-ug)，采用Western blot方法檢測ephrinB1-Fc注射

4、后10分鐘，30分鐘，2，8，24，48小時(shí)及免疫組織化學(xué)方法檢測ephrinB1-Fc注射后30分鐘皮膚p-ERK、p-JNK、p-p38表達(dá)。 3.為觀察MAPKs抑制劑對(duì)EphrinB1-Fc引起的痛行為表達(dá)的影響，EphrinB1-Fc0.5μg注射前30分鐘，注射不同劑量MAPKs抑制劑(ERK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125、p38抑制劑SB203580，0.02，0.1，0.5-μg溶于10μl 1％

5、的二甲亞砜中)，觀察EphrinB1-Fc注射后30分鐘內(nèi)小鼠自發(fā)痛行為，注射后1，2，4，8，24小時(shí)熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值：為觀察MAPKs抑制劑對(duì)EphrinB1-Fc引起的痛行為維持的影響，在注射EphrinB1-Fc0.5μg 1小時(shí)后給予MAPKs抑制劑，觀察注射抑制劑后30分鐘，1，2，4，8小時(shí)熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法檢測末次給藥后一小時(shí)脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)。

6、 4.為研究脊髓水平MAPKs在ephrinB1-Fc引起的痛覺過敏中的作用，采用Western blot方法檢測ephrinB1-Fc注射后30分鐘內(nèi)脊髓p-ERK、p-JNK、p-p38的含量；為觀察MAPKs對(duì)ephrinB1-Fc引起的痛行為表達(dá)及維持的影響，在注射EphrinB1-Fc0.5μg前30分鐘或一小時(shí)后鞘內(nèi)給予MAPKs抑制劑，觀察未次給藥后1，2，4，8小時(shí)熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值。 5.為觀

7、察EphB受體是否參與福爾馬林引起的外周MAPKs的激活，在注射福爾馬林(2％，10μl)前30分鐘，于同一部位注射EphB1-Fc(0.5-ug)，記錄注射福爾馬林后0～5 min和15～30 min的累積舔足時(shí)間和縮足反應(yīng)次數(shù)，免疫組織化學(xué)方法檢測福爾馬林注射后30min內(nèi)皮膚p-p38，p-ERK，p-JNK表達(dá)及一小時(shí)后脊髓Fos蛋白表達(dá)。 6.為觀察NMDA受體是否參與了EphrinB1-Fc引起的MAPKs的激活，注

8、射ephrinB1-Fc(0.5-ug)前30分鐘注射NMDA受體抑制劑MK801(2.5-μg)，Westernblot方法觀察ephrinB1-Fc注射后30分鐘內(nèi)皮膚p-ERK、p-JNK、p-p38的表達(dá)及30分鐘，1，2，4，8小時(shí)熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值。 結(jié)果: 1.不同劑量ephB受體興奮劑ephrinB1-Fc注射于小鼠右足底，注射后30分鐘小鼠的熱縮足反射潛伏期及機(jī)械縮足反射閾值呈劑量依賴性

9、降低，至少持續(xù)到8小時(shí)，24小時(shí)后趨于正常；ephrinB1-Fc在注射后30分鐘內(nèi)，劑量依賴性增加小鼠舔足時(shí)間和舔足次數(shù)；足底注射ephB受體抑制劑ephB1-Fc(0.5ug/10ul)未引起小鼠痛行為及基礎(chǔ)痛閩的改變，預(yù)先注射ephB1-Fc能部分阻斷ephfinB1-Fc引起的痛行為；i.p1.ephrinB1-Fc(0.5-μg)能夠引起同側(cè)脊髓背角淺層Fos蚩白表達(dá)增加，且被EphB1-Fc阻斷。 2.與行為學(xué)結(jié)果一致，ep

10、hfinB1-Fc皮下注射10分鐘皮膚內(nèi)p-ERK、p-JNK表達(dá)顯著增加，30分鐘內(nèi)p-p38表達(dá)顯著增加。磷酸化MAPK的表達(dá)在注射后2小時(shí)趨于正常，磷酸化MAPK的表達(dá)與ephrinB1-Fc呈劑量依賴性。免疫組化結(jié)果也顯示皮膚pMAPKs表達(dá)增加。 3.預(yù)先注射p38抑制劑SB203580，ERK抑制劑U0126，JNK抑制劑SP600125(每種抑制劑0.02，0.1，0.5ug均溶于1％的DMSO內(nèi))能阻斷ephri

11、nB1-Fc引起的痛覺異常并縮短舔足時(shí)間，且呈劑量依賴性；皮下注射ephfinB1-Fc 1小時(shí)后注射MAPKs抑制劑，3種MAPKs抑制劑均能逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc引起的痛行為，并且至少持續(xù)至注射抑制劑后8小時(shí)；預(yù)先注射抑制劑或ephrinB1-Fc注射1小時(shí)后注射抑制劑，均能減少ephrinB1-Fc引起的脊髓水平Fos蛋白表達(dá)。 4.足底注射ephrinB1-Fc增加脊髓水平MAPKs的表達(dá)，預(yù)先鞘內(nèi)注射抑制劑或eph

12、rinB1-Fc注射1小時(shí)后注射抑制荊，能阻斷或逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc引起的痛覺過敏。 5.預(yù)先注射EphB1-Fc，減少福爾馬林引起的舔足時(shí)間，縮足反應(yīng)次數(shù)及脊髓Fos蛋白、皮膚p-p38，p-ERK,p-INK表達(dá)。 6.預(yù)先注射MK801能夠阻斷EphrinB1-Fc引起的熱痛覺過敏、機(jī)械性痛覺異常及皮膚MAPKs激活。 結(jié)論: 1.激活外周ephrinBs/EphBs信號(hào)產(chǎn)生MAPK介導(dǎo)的痛覺