利用親和素磁珠法開發(fā)毛竹SSR引物.pdf

1、微衛(wèi)星或簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）近年來發(fā)展起來的一種新的DNA分子標(biāo)記，因其具有保守性、高多態(tài)性、共顯性等特點，是毛竹（Phylbstachys pubescens）基因組研究不可或缺的一種重要工具。磁珠富集法是一種快速、高效分離微衛(wèi)星分子標(biāo)記的方法。本研究在參考其它文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化親和素磁珠技術(shù)構(gòu)建毛竹基因組SSR位點富集文庫。
　　 在文庫構(gòu)建過程中，用EcoRⅠ分別和

2、DraⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、PvuⅡ四種平端限制性內(nèi)切酶對毛竹基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切片段回收后與根據(jù)抑制性PCR原理設(shè)計的接頭連接。在利用親和素磁珠富集含有SSR序列的DNA片段過程中，對雜交、漂洗及洗脫步驟進(jìn)行優(yōu)化?；厥债a(chǎn)物經(jīng)PCR擴增及轉(zhuǎn)化后，得到約2000個克隆。通過三引物特異PCR篩選，得到約300個含有SSR位點的陽性克隆，文庫的陽性克隆率為19％左右，依據(jù)陽性克隆率并結(jié)合測序結(jié)果對富集SSR文庫進(jìn)行評價，確定了一條

3、簡單、經(jīng)濟、高效分離竹類植物SSR標(biāo)記的方法。對其中150個陽性克隆進(jìn)行測序并分析，AG重復(fù)占到96.3％，AC重復(fù)占到4.7％。將其中62個SSR重復(fù)次數(shù)大于8次，并且位置居中的序列提交到GenBank并將其進(jìn)行歸類。其中復(fù)合型的微衛(wèi)星共9個占16.3％，完美型的35個占56.3％，非完美型的27個占43.7％。SSR重復(fù)數(shù)在10次以下的為11個，重復(fù)10-20次的為37個，重復(fù)20次以上的為14個.
　　 根據(jù)序列設(shè)計SSR