意向性運(yùn)動療法對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)可塑性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦卒中是一種高發(fā)病率、高死亡率，并致大多數(shù)的存活者遺留不同程度的生理、認(rèn)知和心理障礙的疾病。多年來，許多學(xué)者對興奮性氨基酸受體AMPA受體在缺血性腦卒中的神經(jīng)毒性作用了解甚多。在腦缺血的急性期，普遍認(rèn)為AMPA受體亞單位GluR2表達(dá)下調(diào)或GluRl、GluR3／GluR2比值增加致Ca<'2+>內(nèi)流增多或遲發(fā)性細(xì)胞內(nèi)zn<'z+>濃度升高引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，但是在腦缺血急性期過后，AMPA受體發(fā)揮怎樣的作用并不清楚。 自19

2、95年Liao等人在《Nature》雜志一文中首次提出AMPA受體激活“靜默突觸”后，已將研究的焦點(diǎn)從AMPA的神經(jīng)毒性作用轉(zhuǎn)向AMPA的可塑性方面。目前，已在正常的神經(jīng)元細(xì)胞和組織中就AMPA受體的可塑性進(jìn)行了大量的研究，認(rèn)為AMPA受體的數(shù)量和亞單位的構(gòu)成與突觸的可塑性關(guān)系密切，它能增強(qiáng)突觸的傳遞效能。那么在腦缺血狀態(tài)下，AMPA受體是否也具有突觸可塑性尚無文獻(xiàn)報(bào)道；在局灶性腦缺血的不同時(shí)期，AMPA受體是介導(dǎo)神經(jīng)毒性作用還是參與突

3、觸可塑性也不清楚；不同時(shí)期，缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體的表達(dá)及作用機(jī)理是否有所不同還需要進(jìn)一步闡明。 目的：探討AMPA受體在大鼠局灶性腦缺血不同時(shí)期缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體基因及蛋白的表達(dá)，并同時(shí)觀察凋亡陽性細(xì)胞數(shù)，以進(jìn)一步闡述AMPA受體在局灶性腦缺血的作用機(jī)制。 方法：選擇七周齡雄性純系，體重200～300 g左右Sprague-Dawley大鼠184只，按抽簽法隨機(jī)分成以下各組：正常對照組、假手術(shù)組、M

4、CAO組。假手術(shù)組、MCAO組分成再灌后1h、 ld、3d、7d、15d、30d組。采用線栓法建立大腦中動脈梗塞(MCAO)模型。分別采用免疫組化、RT-PCR、ninnel染色檢測各組大鼠缺血中心區(qū)與半暗帶或相應(yīng)部位AMPA受體亞單位GllaR2蛋白、GluRl～G1uR4mRNA及凋亡情況。 結(jié)果：(1)TUNNEL染色結(jié)果顯示假手術(shù)組偶見散在的凋亡陽性細(xì)胞。在缺血中心區(qū)，MCAO再灌1小時(shí)即檢測到表達(dá)非常弱但數(shù)目較多的凋

5、亡細(xì)胞，再灌l(xiāng)天后更為明顯，3天和7天凋亡細(xì)胞在數(shù)量上和表達(dá)程度上達(dá)到高峰，15天均可見大量的凋亡細(xì)胞，與健側(cè)、假手術(shù)組和正常組比較均有顯著性差異。一月后只見中心區(qū)少許凋亡細(xì)胞。在半暗帶區(qū)，MCAO再灌后3天，7天和15天在缺血中心區(qū)周邊可見少許TLJNNEL陽性細(xì)胞。(2)在缺血側(cè)中心區(qū)(ischemia coreIC)，免疫組化結(jié)果顯示再灌l(xiāng)天后G1lJR2蛋白表達(dá)開始減少，3天明顯減少甚至缺失，減少持續(xù)7—15天，與對照組比較有顯

6、著性差異。30天基本上與健側(cè)相同。在缺血半暗帶，再灌后15天G1uR2蛋白表達(dá)稍增強(qiáng)，再灌30天后半暗帶區(qū)GluR2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與健側(cè)、假手術(shù)組和正常組比較均有顯著性差異。(3)在缺血的中心區(qū)，再灌后1天GllJR2 mRNA表達(dá)開始減少，再灌后3天達(dá)到高峰，表達(dá)減少持續(xù)到7天，再灌15天后基本恢復(fù)正常。在半暗帶區(qū)，再灌1天GluR2mRNA表達(dá)開始減少，至3天達(dá)到高峰，減少持續(xù)到再灌后15天，再灌后30天基本恢復(fù)正常。(4)在缺

7、血中心區(qū)，再灌后3天G1uRl mRNA表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)相比有顯著性差異。在缺血半暗帶，再灌后1天GluRl mRNA下調(diào)，再灌后3天表達(dá)下調(diào)更為明顯。再灌后30天G1uRlmRNA表達(dá)上調(diào)，與假手術(shù)組和正常組比較有顯著性差異。 (5)在缺血中心區(qū)， MCAO 2小時(shí)再灌后各時(shí)間點(diǎn)GlLIR3 mRNA與對照組相比均未見明顯差異。在缺血半暗帶，再灌后3天出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)比較有顯著性差異。再灌后15天、30天GhlR3 mRNA表

8、達(dá)上調(diào)，與健側(cè)組比較有顯著性差異。(6)在缺血中心區(qū)，MCAO 2小時(shí)再灌后3天，GluR4 mRNA表達(dá)下調(diào)，與健側(cè)比較有顯著性差異。在半暗帶，再灌后3天G1LuR4 mRNA表達(dá)下調(diào)，與對照組比較有顯著性差異。再灌后15天GluR4 mRNA表達(dá)上調(diào)，再灌30天達(dá)到高峰。 結(jié)論： (1)首次發(fā)現(xiàn)MCAO模型鼠缺血中心區(qū)AMPA受體不是凋亡的超早期啟動因子。(2)在缺血中心區(qū)和半暗帶，MCAO再灌后早期GluR2下調(diào)或Glu

9、Rl、G1uR3或GhlR4／G1uR2比值增加引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，GluR2蛋白水平在缺血半暗帶處于亞穩(wěn)定狀態(tài)。 (4)首次提出在MCAO再灌亞急性期，缺血中心區(qū)AMPA受體無介導(dǎo)突觸可塑性的作用，而缺血半暗帶AMPA受體可能增強(qiáng)了突觸的傳遞效能，從分子生物學(xué)途徑對意向性運(yùn)動療法對大鼠局灶性腦缺血可塑性研究提供了理論基礎(chǔ)。 盡管意向性運(yùn)動療法能明顯改善患者的運(yùn)動功能，但其作用機(jī)制并不清楚。因此我們首次建立MCAO大鼠意向性

10、運(yùn)動治療模式，探討意向性運(yùn)動療法對MCAO大鼠的運(yùn)動功能的影響及意向性運(yùn)動療法的可能作用機(jī)制。研究表明AMPA受體能激活“靜默突觸”，增加突觸的傳遞效能。另外，豐富飼養(yǎng)環(huán)境能使小鼠活動增多，海馬區(qū)的G1uR2和GluR4基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，從而增強(qiáng)突觸可塑性。那么意向性運(yùn)動療法通過食物刺激誘導(dǎo)大鼠偏癱側(cè)的運(yùn)動是否同樣可以改變AMPA的表達(dá)，調(diào)動可塑性機(jī)制，刺激MCA0大鼠發(fā)揮潛能，從而達(dá)到運(yùn)動恢復(fù)的目的值得我們?nèi)ヌ接憽?目的：探討

11、意向性運(yùn)動療法干預(yù)對MCAO再灌后大鼠各時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動功能及缺血中心區(qū)與半暗帶AMPA受體的影響，闡明意向性運(yùn)動療法的可能機(jī)制。 方法：大鼠選擇同第一部部分。將126只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成意向性運(yùn)動療法組(Willed movement WM)和飼養(yǎng)環(huán)境改變組(Environment Modification EM)。其中WM和EM組又分成再灌后3d、 7d、15d、30d組。兩組大鼠分別給予爬梯頻率、前后肢抓

12、握功能評分、神經(jīng)功能評分。大鼠模型制備及AMPA蛋白及基因檢測同第一部分。 結(jié)果：(1)MCAO再灌后各時(shí)間點(diǎn)WM組大鼠爬梯次數(shù)明顯多于EM組。再灌后30天，WM組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯低于MCAO組。再灌后15～30天，WM組大鼠爬梯時(shí)前肢抓握功能改善更為明顯，而后肢的抓握功能在各時(shí)間點(diǎn)兩組間均無明顯差別。(2)免疫組化結(jié)果顯示在缺血中心區(qū)WM組、EM組和MCAO組間GluR2蛋白表達(dá)無明顯差異。在缺血半暗帶，再灌后30天，wM組

13、GluR2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)且陽性細(xì)胞數(shù)目也增多，與MCAO組比較有顯著性差異，而與EM組無明顯差異。(3)在缺血中心區(qū)，WM組在再灌后各時(shí)相點(diǎn)GluRl mRNA表達(dá)與MCAO組和EM組相比均未見明顯差異。在缺血半暗帶， WM組在再灌后15～30天GluRl mRNA表達(dá)上調(diào)，與MCAO組比較有顯著性差異，與EM組未發(fā)現(xiàn)明顯差異。(4)在缺血中心區(qū)與半暗帶，WM組、EM組和MCAO組比較GhaR3 mRNA在再灌后各時(shí)相點(diǎn)未見明顯差異

14、。(5)在缺血中心區(qū)，3組間在再灌后各時(shí)相點(diǎn)GluR4 mRNA表達(dá)未見明顯差異。在缺血半暗帶，WM組在再灌后15～30天G1uR4 mRNA表達(dá)上調(diào)與MCAO組比較有顯著性差異。EM組在再灌后15～30天GluR4 mRNA表達(dá)同樣上調(diào)，與MCAO組比較有顯著差異，但WM組和EM組在再灌各時(shí)間點(diǎn)GluR4 mRNA表達(dá)均未見明顯差別。 結(jié)論：(1)首次成功建立MCAO大鼠意向性運(yùn)動治療模式。(2)在局灶性腦缺血亞急性期，意向性