麝冰合劑對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠影響的實驗研究.pdf

1、腦卒中是當今世界上最重要的致死性疾病之一，中國人群腦卒中發(fā)病率、死亡率在總死亡中所占比例，城市為20％，農(nóng)村為19％。而在腦卒中中，缺血性中風占80％以上。臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復血液再灌注，然而近年來發(fā)現(xiàn)，恢復缺血區(qū)的血供后，在一定程度上反而更加重了缺血性腦損傷，使腦細胞死亡數(shù)量進一步增加，加重病情，這種血流再通后引起的繼發(fā)性損傷稱為腦缺血再灌注損傷(cerebralischemia reperfusion injury

2、 CIRI)，腦缺血再灌注損傷的存在使腦組織的功能障礙和結構損傷更嚴重，死亡率更高，大大降低了治療效果，引起世人的廣泛關注，成為近年來腦缺血研究的一個熱點。 腦缺血再灌注損傷是一復雜的病理生理過程，其具體機制目前尚不完全清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦的細胞產(chǎn)生損傷是一個快速的級聯(lián)反應，這個級聯(lián)反應包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、氧自由基的大量釋放、細胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細胞內鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激

3、活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導致細胞凋亡或壞死。 血循環(huán)重建后的再灌注性腦損傷日益增多，但目前還沒有理想的治療腦缺血再灌注損傷的藥物。導師彭勝權教授根據(jù)長期的臨床實踐，認為腦為元神之府，清竅之所在，腦主神明，臨床腦卒中的患者的病機主要是清竅閉阻，氣血逆亂，故提出腦卒中的早期治療應以芳香開竅為主，用藥時可以麝香、冰片為主，再結合患者個體差異，辨證論治。麝香可“通諸竅之不利，開經(jīng)絡之壅遏”，是治療

4、腦病和其它危重疾病的常用藥物。冰片亦是開竅醒神的常用藥，多用于中風，痰熱，神昏竅閉等癥，常作輔藥或引經(jīng)藥用，與麝香同用，可加強其療效。 基于以往臨床與實驗研究的成果，本課題從實驗研究角度從整體和分子水平全面去探討麝香配伍冰片抗腦缺血再灌注損傷的機制。拓寬中藥防治腦缺血再灌注損傷的思路，為提高中藥的臨床療效提供科學依據(jù)。 1 麝冰合劑抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的療效觀察 1.1 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的復制與

5、評價 目的：復制SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并評價效果。 方法：通進改良線栓法建立中動脈腦缺血再灌注模型，并對模型進行早期行為學及組織學觀察評價。 結果：大鼠表現(xiàn)為不同程度的局灶性神經(jīng)功能障礙，肉眼觀察缺血側大腦組織腫脹明顯，光鏡下觀察腦神經(jīng)細胞多數(shù)神經(jīng)細胞核固縮，細胞外空隙明顯增寬，間質疏松，顯示細胞周圍及間質水腫。 結論：成功復制了 MCAO 模型。 1.2 麝冰合劑對局灶性腦缺血再灌注大

6、鼠行為學及腦梗死體積影響的實驗研究 目的：研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學及腦梗死體積的影響。 方法：TTC 染色法檢測腦梗死體積，并比較其神經(jīng)功能行為積分。 結果：腦缺血 2h再灌注 24h，模型組腦梗死體積顯著增大，與假手術組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，神經(jīng)功能行為積分顯著升高(P<0.01)；麝香配伍冰片組腦梗死體積較模型組縮小(P<0.01)，同時，麝香冰片組、麝香組大鼠神經(jīng)功能行為積

7、分下降(P<0.05)。其中以麝香配伍冰片組作用最明顯。 結論麝香配伍冰片可減少局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，改善腦缺血后神經(jīng)行為癥狀。 1.3 麝冰合劑對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦含水量及血腦屏障通透性的影響 目的：研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦含水量及血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)通透性的影響。 方法：干濕重法觀察腦含水量的變化，通過收集透出腦血管外的伊文思藍

8、(Evans Blue，EB)來示蹤BBB的變化。 結果：腦缺血2 h再灌注24h，模型組較假手術組腦含水量及EB含量明顯增加(P<0.01)，血腦屏障遭到破壞；麝香配伍冰片組腦含水量較模型組明顯降低 (P<0.05)，麝香配伍冰片組及冰片組EB 含量較模型組明顯降低 (P<0.01)。 結論：麝香配伍冰片可有效降低腦缺血再灌注后腦含水量及血腦屏障的通透性，對血腦屏障結構有一定的保護作用。 1.4 麝冰合劑對局灶

9、性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元超微結構影響的實驗研究 目的：研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元及突觸超微結構的影響。 方法：運用透射電鏡觀察大腦頂葉皮質神經(jīng)元超微結構及突觸的變化。 結果：腦缺血2h再灌注24h，大腦皮層神經(jīng)元的超微結構形態(tài)損壞明顯，可見神經(jīng)細胞縮小，線粒體腫脹，粗面內質網(wǎng)擴張等病變。麝香配伍冰片對大腦皮層神經(jīng)元有不同程度的保護或修復作用。模型組較假手術組神經(jīng)氈內突觸明顯減少(P<0.01)

10、，典型的突觸結構遭到破壞；麝香配伍冰片組突觸數(shù)量較模型組明顯增多 (P<0.05)，突觸形態(tài)大部分接近正常。 結論：麝香配伍冰片可有效防止腦缺血再灌注導致的皮質內突觸數(shù)量的減少，對神經(jīng)元及神經(jīng)元突觸超微結構有一定的保護作用。 2 麝冰合劑抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的分子機制研究 2.1 麝冰合劑對局灶性腦缺血再灌注大鼠 AQP-4 mRNA 表達影響的研究 目的：研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠

11、腦組織 AQP-4 mRNA 表達的影響。 方法：應用實時熒光定量PCR技術，通過制備 TaqMan 探針進行測定。 結果：與假手術組比較，模型組缺血側腦組織 AQP-4 mRNA 表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，麝香配伍冰片組、冰片組、缺血側腦組織 AQP-4 mRNA 表達明顯降低(P<0.05)。 結論：麝香配伍冰片組和冰片組可明顯抑制 AQP-4 mRNA 的表達。 2.2 麝冰合劑對

12、局灶性腦缺血再灌注大鼠 ICAM-1 mRNA 表達影響的實驗研究 目的：研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織 ICAM-1 mRNA 表達的影響。 方法：應用實時熒光定量PCR技術，通過制備TaqMan探針進行測定。 結果：與假手術組比較，模型組缺血側腦組織ICAM-1 m=RNA 表達量明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，各組缺血側腦組織 ICAM-1 tuRNA 表達均明顯降低(P<0.05～

13、0.01)，其中麝香冰片組下降最明顯(P<0.01)。 結論：麝香配伍冰片可抑制腦缺血再灌注后ICAM-1 的表達，從而抑制腦缺血再灌注時白細胞與內皮細胞間的粘附，減輕缺血性腦損傷。 3 本課題的特色和創(chuàng)新性 麝香及冰片單味藥的基礎和臨床研究國內外都有著較豐富的資料，但是使用動物實驗從整體和分子水平全面系統(tǒng)評價這一藥對抗腦缺血再灌注損傷的作用尚屬首次。在模型方面我們采用了與臨床病人發(fā)病情況相類似的SD大鼠MCAO

14、局灶性腦缺血再灌注模型，運用早期行為學及組織學觀察評價，通過改良線栓法成功復制了此模型，穩(wěn)定性、重復性較好。在國內外之前的有關腦缺血再灌注損傷研究中，AQP-4與ICAM-1的傳統(tǒng)的檢測方法均為RT-PCR方法或免疫組化法，我們首次運用了實時熒光定量PCR檢測方法，通過制備AQP-4與ICAM-1基因的TaqMan探針，以重組質粒為模板繪制標準曲線研究麝香配伍冰片對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織腦水腫相關基因AQP-4 mRNA 與炎癥反