單純性馬蹄內(nèi)翻足遺傳易感基因的定位與鑒定.pdf

1、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)位于6q12-13區(qū)域內(nèi)的D6S348位點(diǎn)與單純性ICTEV顯著相關(guān)(P<0.01)。提示在此位點(diǎn)附近可能存在單純性ICTEV的遺傳易感基因，為此在該位點(diǎn)附近選擇了10個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)遺傳標(biāo)記：D6S965、D6S1681、D6S280、D6S1036、D6S493、D6S313、D6S239、D6S493、509-8B2F/509-8B2R、D6S1031,對(duì)84個(gè)核心家系252位成員進(jìn)行基因型分析和傳遞不平衡檢驗(yàn)(T

2、ransmissionDisequilibriam Test，TDT)，首次將單純性馬蹄內(nèi)翻足遺傳易感基因定位至6q12-13內(nèi)的6.04cM，同時(shí)采用候選克隆策略，首次證明該候選區(qū)域內(nèi)的COL9A1基因與單純性ICTEV相關(guān)。 研究材料與方法： 標(biāo)本：84個(gè)ICTEV核心家系252名成員均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院小兒骨外科。所有患者均具有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)X線檢查及手術(shù)確診。抽取患兒及其父母外周靜脈血5ml，枸櫞酸

3、鈉抗凝后-20℃凍存，備用。肌肉及肌腱標(biāo)本來(lái)自于25例手術(shù)矯正的馬蹄內(nèi)翻足患兒，取外傷及尸檢患兒相應(yīng)組織作為正常對(duì)照，所有標(biāo)本均經(jīng)患者知情同意。馬蹄內(nèi)翻足大鼠模型來(lái)源于本課題組。 一、微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)的選擇。根據(jù)各個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目、雜合度及多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content，PIC)值，選擇染色體6q12-13區(qū)域內(nèi)10個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)進(jìn)行TDT檢驗(yàn)。所有位點(diǎn)均選自基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(

4、Genome Database，GDB)。 二、基因型分析。常規(guī)飽和氯化鈉鹽析法提取外周血DNA。PCR-STR方法檢測(cè)擴(kuò)增片斷，進(jìn)行基因型分析。 三、TDT檢驗(yàn)和遺傳多態(tài)分析。對(duì)84個(gè)核心家系成員進(jìn)行TDT檢驗(yàn)。對(duì)有意義的微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族人群中進(jìn)行遺傳多態(tài)分析。采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率和雜合度。依據(jù)Hardy-weinberg定律計(jì)算各微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率和雜合度預(yù)期值

5、，采用x<'2>檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)。 四、COL9A1基因與單純性ICTEV相關(guān)性研究。在COL9A1基因編碼區(qū)選擇2個(gè)可引起氨基酸改變的cSNP：rs592121與rsl135056。常規(guī)PCR擴(kuò)增后，采用PCR-RFLP方法對(duì)84個(gè)單純性ICTEV核心家系進(jìn)行基因型分析。應(yīng)用ETDT軟件統(tǒng)計(jì)分析各SNP位點(diǎn)基因型與單純性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性；應(yīng)用TRANSMIT軟件構(gòu)建單體型并統(tǒng)計(jì)分析單體型頻率

6、是否存在差異；同時(shí)采用半定量RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)馬蹄內(nèi)翻足模型鼠及25例馬蹄內(nèi)翻足患兒肌肉及肌腱組織COL9A1基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況。 五、COL9A1基因表達(dá)調(diào)控的初步研究PCR-SSCP方法進(jìn)行COLgA1基因近端啟動(dòng)子突變篩查。構(gòu)建COLgA1基因近端啟動(dòng)子及內(nèi)含子熒光素酶報(bào)告基因載體990Luc及990LucInt，轉(zhuǎn)染Bel、823及人成纖維細(xì)胞系，檢測(cè)熒光素酶活性；構(gòu)建COL9A1基因990bp

7、各種截短型熒光素酶報(bào)告基因載體990Luc、704Luc、548Luc、162Luc、420Luc、336Luc、217Luc及157Luc，轉(zhuǎn)染Bel、823及人成纖維細(xì)胞系，檢測(cè)熒光素酶活性；應(yīng)用P-Match軟件在人類COLgA1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-275到-403和-275到-185位置分別預(yù)測(cè)了1個(gè)C/EBP轉(zhuǎn)錄因子及SOX9轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建了COLgAl基因的M1、M2、M3、M4熒光素酶報(bào)告基因載體，轉(zhuǎn)染Bel

8、細(xì)胞系，檢測(cè)熒光素酶活性，觀察C/EBP及SOX9對(duì)COLgA1基因表達(dá)的作用。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、基因型分析結(jié)果D6S493位點(diǎn)只見一個(gè)等位基因，在分析時(shí)去除。84個(gè)核心家系在其余9個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)基因型分析結(jié)果符合孟德爾遺傳。 二、TDT檢驗(yàn)結(jié)果D6S1036、D6S239、D6S421、D6S1681、509-882F/R、D6S280、D6S313等7個(gè)位點(diǎn)經(jīng)TDT檢驗(yàn)存在連鎖不平衡(覆蓋6q12-13區(qū)域

9、，6.04aM)，P<0.05，與單純性馬蹄內(nèi)翻足相關(guān)；而在D6S965及D6S1031位點(diǎn)未檢測(cè)出連鎖不平衡的存在，P>0.05。 三、遺傳多態(tài)性分析結(jié)果100名無(wú)血緣關(guān)系個(gè)體在D6S1036、D6S239、D6S1681、D6S421、509-882F/R、D6S280和D6S313 7個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)分別檢測(cè)到5、6、6、6、8、6、5個(gè)等位基因，12、18、19、14、27、19和10種基因型。x<'2>檢驗(yàn)顯示，各微衛(wèi)

10、星多態(tài)位點(diǎn)不同基因型個(gè)體數(shù)的觀察值和預(yù)期值之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，表明該群體符合Hardy-Weinberg平衡。在D6S1036、D6S239、D6S1681、D6S421、509882F/R、D6S280和D6S313 7個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)中，雜合度最高的是D6S1681及509-882F/R，為85％，雜合度最低的是D6S1036及D6S313，為77％，均具有較好的多態(tài)性。 四、COL9A1基因PCR-RFLP結(jié)

11、果Rs592121 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為151bp，當(dāng)?shù)任换驗(yàn)镚時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Hae Ⅲ酶切后形成101bp和50bp片段；而等位基因?yàn)锳時(shí)，PCR產(chǎn)物不能被切。Rs1135056PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為287bp，當(dāng)?shù)任换驗(yàn)镚時(shí)，PCR產(chǎn)物經(jīng)SamⅠ酶切后形成160bp和127bp片段；而等位基因?yàn)锳時(shí)，PCR產(chǎn)物不能被切。 五、COL9A1基因測(cè)序和基因型分析結(jié)果COL9A1基因2個(gè)SNP不同基因型經(jīng)測(cè)序證實(shí)。84個(gè)核心家系基因型

12、分析結(jié)果符合孟德爾遺傳。 六、COL9A1基因與單純性馬蹄內(nèi)翻足的相關(guān)性分析單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：rs592121位點(diǎn)x<'2>=12．488，P<0.05；rs1135056位點(diǎn)x<'2>=15.622，P<0.05。rs592121及rs1135056均見有意義的關(guān)聯(lián)。配對(duì)連鎖不平衡檢驗(yàn)表明rs592121與rsll35056之間存在連鎖不平衡(D’=0.917065)。對(duì)存在連鎖不平衡的rs592121和rs113505

13、6進(jìn)行單體型分析，共觀察到4種基因型，但總體P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 七、COL9A1基因在馬蹄內(nèi)翻足模型鼠及患兒組織中的表達(dá)半定量RT-PCR研究表明72.4％(21/29)的馬蹄內(nèi)翻足模型鼠中COL9A1基因表達(dá)上調(diào)，而正常胎鼠中未發(fā)現(xiàn)COL9A1基因表達(dá)上調(diào)。單純性馬蹄內(nèi)翻足患兒肌肉及肌腱組織中COL9A1基因表達(dá)水平高于正常組織(t=4.7500，P<0.05)。免疫組化結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果表明COL9A

14、1基因表達(dá)上調(diào)與先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)生具有相關(guān)性。 八、COL9A1基因近端啟動(dòng)子突變篩查結(jié)果應(yīng)用PCR-SSCP方法對(duì)COL9A1基因近端啟動(dòng)子進(jìn)行突變篩查，未發(fā)現(xiàn)突變。 九、COL9A1基因表達(dá)調(diào)控的初步研究結(jié)果酶切和測(cè)序結(jié)果說(shuō)明，COL9A1基因近端啟動(dòng)子990Luc及啟動(dòng)子內(nèi)含子990LucInt熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明：990Luc的啟動(dòng)子活性(以相對(duì)熒光素酶活性M1/M2表示)為0.192

15、，為pGL3-basic活性的480倍，表明我們克隆的COL9A1基因上游990bp片段具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。而990LucInt的相對(duì)熒光素酶活性為0.174，為pGL3-basic活性的435倍，與990Luc活性相差不多，說(shuō)明第一內(nèi)含子沒有明顯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性；各種截短型熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染結(jié)果表明：-559到-403之間、-275到-195之間可能存在著正調(diào)控元件，而在-403到-275之間可能存在著負(fù)調(diào)控元件。針對(duì)-275到

16、-195及-403到-275之間設(shè)計(jì)的缺失型及突變型載體轉(zhuǎn)染結(jié)果表明：SOX9的結(jié)合位點(diǎn)位于COL9A1基因近端啟動(dòng)子的-275～257之間，可能是COL9A1基因的正調(diào)控元件。而C/EBP的結(jié)合位點(diǎn)位于COL9A1基因近端啟動(dòng)子的-321～312之間，可能是COL9A1基因的負(fù)調(diào)控元件。 研究結(jié)論： (1)首次應(yīng)用傳遞不平衡檢驗(yàn)定位單純性ICTEV遺傳易感基因至6q12-13區(qū)域的6.04cM。 (2)首次應(yīng)用