用DHPLC技術(shù)進(jìn)行單純性先天性心臟病易感基因SORBS2的突變分析.pdf

1、背景與目的:
　　 隨著現(xiàn)代社會(huì)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及醫(yī)學(xué)模式的進(jìn)化，人類疾病譜和死亡譜已經(jīng)發(fā)生了很大改變，出生缺陷已逐漸成為我國(guó)嬰幼兒死亡的主要原因。先天性心臟病(CongenitalHeartDisease，CHD)是胎兒時(shí)期心血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的先天畸形，是出生缺陷中最常見(jiàn)的類型，幾乎占據(jù)了主要出生缺陷的三分之一，在新生兒非感染性死亡中占首位。廣東省優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會(huì)2009年對(duì)廣東省0～5歲兒童出生缺陷情況調(diào)查結(jié)果顯示，先天性心

2、臟病是廣東地區(qū)最常見(jiàn)的出生缺陷，已成為嚴(yán)重影響兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，給社會(huì)和家庭帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神等方面的負(fù)擔(dān)。
　　 先天性心臟病中僅表現(xiàn)為心臟畸形而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常，稱之為單純性先天性心臟病(non-syndromicCHD)，約占80％。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近些年來(lái)的研究證實(shí)，該病是與環(huán)境因素相關(guān)的多基因遺傳病，其遺傳背景復(fù)雜，致病機(jī)制尚不明確，且其遺傳因素在疾病發(fā)生過(guò)程

3、中存在著明顯的地區(qū)差異和種族差異。由于發(fā)病率極高且患病后果嚴(yán)重，因此，研究該病的致病機(jī)制與易感基因試圖建立行之有效的疾病篩查和診斷技術(shù)可及早預(yù)防重型先天性心臟病患兒的出生，以期降低該病的發(fā)病率，不僅可以減少患兒家庭負(fù)擔(dān)，而且對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)和人口質(zhì)量具有重要意義。
　　 心臟發(fā)育是胚胎發(fā)育過(guò)程中一個(gè)及其復(fù)雜的事件，許多基因按照時(shí)空順序的表達(dá)調(diào)控著心臟的正常發(fā)育，其中任何一個(gè)基因的異常都有可能導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。單純性CHD

4、的致病基因很多，它們之間存在相互影響和協(xié)同調(diào)節(jié)，在心臟發(fā)育的不同時(shí)期有著不同的表達(dá)與調(diào)節(jié)。并且與許多和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、能量代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、LIM蛋白、鋅指蛋白等相關(guān)的蛋白基因在心臟發(fā)育中相互協(xié)調(diào)、相互作用，形成有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因而，心臟并不是一個(gè)靜態(tài)的器官，將心臟的發(fā)育與身體其他器官分開(kāi)來(lái)看是錯(cuò)誤的;把兒童與成人的心臟疾患完全區(qū)分開(kāi)也是有失公允的。心臟從開(kāi)始發(fā)育，到最終成熟，再到成熟后的功能維護(hù)，是一個(gè)動(dòng)態(tài)

5、的、整體的過(guò)程。
　　 目前，對(duì)先天性心臟病的研究分為四個(gè)方面:配體受體如NOTCH1、NODAL等;轉(zhuǎn)錄因子如GATA4、NKX2.5、TFAP2B等心臟發(fā)育早期的重要轉(zhuǎn)錄因子;收縮蛋白如MYH1、ACTC等，其他復(fù)雜基因如FLNA、ELN等。尤以轉(zhuǎn)錄因子的研究最多，涉及到其他遺傳學(xué)機(jī)制的分析報(bào)道較少，存在很大空白。心臟的發(fā)育涉及多種基因的相互調(diào)控與影響，而且與這些基因在不同時(shí)間和不同空間的先后表達(dá)和相互作用有關(guān)，其中任何基因

6、表達(dá)的質(zhì)或量的異常也可能會(huì)影響心臟的發(fā)育。在心臟表達(dá)的蛋白很多，其中銜接蛋白就屬于其中一類，而我們對(duì)于這一類蛋白在心臟中的表達(dá)調(diào)控功能還知之甚少。銜接蛋白由兩個(gè)或兩個(gè)以上的沒(méi)有酶活性的蛋白質(zhì)相互作用組成，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能。Vinexin，CAP/ponsin，與SORBS2(ArgBP2)構(gòu)成一個(gè)新的銜接蛋白家族，它們有與活性肽sorbin同源的SoHo保守區(qū)域，以及3個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域（Src同源3）。與該銜接蛋白家族相聯(lián)系的一部分蛋白已

7、經(jīng)確定。有越來(lái)越多的證據(jù)表明，該蛋白家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增，遷移，黏附，凋亡，細(xì)胞骨架和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。其中的SORBS2蛋白在心臟大量表達(dá)，它的蛋白產(chǎn)物表達(dá)在心肌肌原纖維的Z帶中，對(duì)于裝配和維持心肌肌原纖維的穩(wěn)定性、附著性有重要作用。
　　 SORBS2又名ArgBP2，是一個(gè)70kD的在非肌肉細(xì)胞中表達(dá)于應(yīng)力纖維，在心臟表達(dá)于Z帶的蛋白質(zhì)。SORBS2定位于4q35.1，共有八種亞型，是通過(guò)不同剪接方式獲得的，分別由4

8、92到1100aa的氨基酸組成。其中大量表達(dá)于心臟的亞型1全長(zhǎng)226794bp，cDNA為4939bp，編碼666個(gè)氨基酸，由23個(gè)外顯子，22個(gè)內(nèi)含子組成。
　　 SORBS2除了在心肌纖維的Z帶發(fā)揮作用之外，還有很多其他功能。通過(guò)羧基末端的SH3結(jié)構(gòu)域與非受體酪氨酸蛋白激酶家族成員c-Abl相互作用，通過(guò)氨基末端的SoHo同源結(jié)構(gòu)域與脂筏蛋白相互作用。由該蛋白在上皮和心肌亞細(xì)胞定位可知，其作為銜接蛋白在應(yīng)力纖維中裝配信號(hào)復(fù)合

9、體;在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性中發(fā)揮重要調(diào)控作用;在錨定連接中，與橋粒黏著斑蛋白協(xié)同作用;結(jié)合泛素連接酶Cbl，非受體酪氨酸激酶c-Abl可磷酸化Cbl，激活的Cbl可以促進(jìn)Abl的降解，發(fā)揮信號(hào)調(diào)節(jié)作用;或者與ATK1復(fù)合介導(dǎo)PAK1通路的激活;通過(guò)抑制細(xì)胞黏附，細(xì)胞遷移等作用抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　　 SORBS2基因在細(xì)胞骨架的穩(wěn)定中有重要作用，作為支架蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)多種集中在細(xì)胞骨架的細(xì)胞信號(hào)通路控制細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)的平

10、衡性。微管、微絲、中間絲及其結(jié)合蛋白構(gòu)成了心肌細(xì)胞的骨架系統(tǒng)，它們?cè)诰S持心肌細(xì)胞正常形態(tài)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞等一系列生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞骨架成分將肌小節(jié)和細(xì)胞外基質(zhì)連接起來(lái)，構(gòu)成一個(gè)收縮力的傳導(dǎo)環(huán)路，起著傳導(dǎo)收縮力以及機(jī)械支撐的作用。心肌細(xì)胞骨架系統(tǒng)作為一種動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，不僅在維持心肌細(xì)胞形態(tài)，參與收縮活動(dòng)中發(fā)揮作用，而且對(duì)心肌離子通道的錨定作用和功能方面有著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞骨架變化往往會(huì)引起心肌缺氧、心肌肥厚及心力衰竭等

11、病理性進(jìn)程。細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白種類繁多，功能復(fù)雜，而銜接蛋白恰是其結(jié)合蛋白中的一種，其確切功能大部分還不清楚。研究細(xì)胞骨架，骨架結(jié)合蛋白及其與心肌離子通道的關(guān)系對(duì)于闡明多種心律失常的發(fā)生機(jī)制有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 因?yàn)樾呐K是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、整體的器官，大量不同種類的基因表達(dá)在其中，調(diào)控著心臟的正常發(fā)育與成熟，以及成熟后的功能維護(hù)。SORBS2作為銜接蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌肌原纖維的穩(wěn)定和細(xì)胞骨架調(diào)控等方面的作用，讓我們將之與心

12、臟的發(fā)育聯(lián)系起來(lái)，并且進(jìn)一步與先天性心臟病的形成聯(lián)系到一起。
　　 近年來(lái)，一種具有高效、精確、高通量、半自動(dòng)化、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)的用于檢測(cè)已知突變及未知突變篩查，敏感性和特異性高達(dá)96％～100％的方法，變性高效液相色譜（DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC）技術(shù)被廣泛的應(yīng)用。與同樣是用于突變篩查的其他變異檢測(cè)技術(shù)相比，變性高效液相色譜有著明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究主要是

13、通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)與基因克隆技術(shù)來(lái)構(gòu)建SORBS2基因的已知變異，并針對(duì)SORBS2基因的所有編碼區(qū)及剪接位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)變性高效液相色譜檢測(cè)方法，并用該檢測(cè)方法篩檢中國(guó)人群?jiǎn)渭冃韵忍煨孕呐K病病例以期找到中國(guó)人SORBS2基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。
　　 本研究旨在為進(jìn)一步研究單純性先天性心臟病分子機(jī)制，建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)且適于中國(guó)人群中國(guó)南方地區(qū)單純性先天性心臟病相關(guān)基因突變的研究方法，并為臨床上該類疾病的診斷、預(yù)防和治療提供參考，同時(shí)也

14、為SORBS2基因突變導(dǎo)致的其他銜接蛋白異常疾病的分子機(jī)制的研究提供借鑒和參考。
　　 材料與方法:
　　 1.標(biāo)本:共收集209例先天性心臟病病例（男性121例、女性84例、未知4例，年齡為0-6個(gè)月）和120例正常人的全血標(biāo)本，這些標(biāo)本大多來(lái)自于中山博愛(ài)醫(yī)院和珠江醫(yī)院等。采用標(biāo)準(zhǔn)的飽和酚/氯仿法從外周血中提取基因組DNA。
　　 2.分子分析方法:
　　 (1).針對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中SORBS2的基因

15、變異采用大引物PCR方法定點(diǎn)誘變和基因克隆方法:首先通過(guò)設(shè)計(jì)定點(diǎn)誘變引物，采用PCR技術(shù)直接從人基因組DNA樣品中獲取目的基因——含某一變異的基因，然后運(yùn)用經(jīng)典的基因工程技術(shù)將其克隆至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌DH5α。每個(gè)克隆重組子中插入的目的基因進(jìn)行DNA測(cè)序以驗(yàn)證基因變異型。
　　 (2).針對(duì)SORBS2基因的所有編碼區(qū)及剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)變性高效液相色譜分析的引物，構(gòu)建SORBS2基因的變性高效液相色譜分析方

16、法。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用建立的SORBS2基因變性高效液相色譜分析方法對(duì)構(gòu)建的包含SORBS2基因已知變異的人工變異體進(jìn)行穩(wěn)定性分析，確定該體系的穩(wěn)定性和可靠性。
　　 4.標(biāo)本篩檢:對(duì)所收集的標(biāo)本進(jìn)行SORBS2基因突變篩查。
　　 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析、總結(jié)。
　　 結(jié)果:
　　 運(yùn)用大引物PCR定點(diǎn)誘變方法人工構(gòu)建包含SORBS2基因已知變異的變異體，并將誘變得到的片段克隆到pMD2

17、0-T-載體后進(jìn)行測(cè)序，所有克隆均鑒定為所需變異，誘變成功率達(dá)100％。
　　 建立的針對(duì)SORBS2基因的變性高效液相色譜分析方法能夠快速、準(zhǔn)確地區(qū)分已知變異序列和野生型序列，并且靈敏性和穩(wěn)定性都好。
　　 收集209例單純性先天性心臟病和120例正常人標(biāo)本，對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行SORBS2基因的變性高效液相色譜分析檢測(cè)，未檢測(cè)到定點(diǎn)誘變的已知變異，也未發(fā)現(xiàn)新的致病突變，只檢測(cè)到4個(gè)已知的單核苷酸多態(tài)性(SNP)和兩個(gè)未報(bào)道

18、過(guò)的位于內(nèi)含子的基因變異。
　　 結(jié)論:
　　 變性高效液相色譜分析技術(shù)是近幾年來(lái)被廣泛應(yīng)用的基因突變檢測(cè)技術(shù)。這種檢測(cè)方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無(wú)需序列特異性探針，無(wú)需純化，在PCR結(jié)束后直接進(jìn)行變性高效液相色譜檢測(cè)，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。這種方法因其操作簡(jiǎn)便、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且靈敏度高而受到普遍的關(guān)注和廣泛應(yīng)用。
　　 本課題研究中建立的針對(duì)SORBS2基因的變性高效液相色譜分析檢

19、測(cè)方法能夠快速、準(zhǔn)確地將SORBS2基因變異序列與野生型序列區(qū)分，并且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和再現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，體系可靠。本研究建立的基于PCR的變性高效液相色譜分析SORBS2基因突變方法是一種高通量、高靈敏度、半自動(dòng)化、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的突變檢測(cè)技術(shù)。
　　 近年來(lái)，銜接蛋白家族的功能不斷被發(fā)掘，其中的SORBS2因在心臟中大量表達(dá)，而被考慮是否與先天性心臟病的形成相聯(lián)系，SORBS2基因的致病突變還未有被報(bào)道，也沒(méi)有對(duì)SORBS2

20、基因進(jìn)行人群突變篩查的研究。本研究中，利用變性高效液相色譜分析技術(shù)對(duì)中國(guó)人先天性心臟病病例標(biāo)本進(jìn)行突變篩查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新致病突變，這也說(shuō)明了中國(guó)人SORBS2基因突變的攜帶率相對(duì)較低。
　　 先天性心臟病作為一種與環(huán)境因素相關(guān)的多基因疾病，雖然已經(jīng)有超過(guò)40種基因被報(bào)道與先天性心臟病的形成有關(guān)，然而對(duì)于它的致病機(jī)理，我們?nèi)匀恢挥袦\顯而初步的認(rèn)識(shí)。已經(jīng)報(bào)道過(guò)的可能與先天性心臟病形成有關(guān)的致病基因中有很大一部分，都只在一些零星的散發(fā)病

21、例中被發(fā)現(xiàn)。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)先天性心臟病的病因分析主要認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子突變?cè)斐傻?，涉及到其他遺傳學(xué)病因分析的報(bào)道較少。根據(jù)PubMed等文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果，未見(jiàn)有關(guān)中國(guó)人群SORBS2基因突變導(dǎo)致先天性心臟病的報(bào)道。因此本研究對(duì)先天性心臟病的遺傳學(xué)病因的研究具有重要的意義和價(jià)值。
　　 綜上所述，雖然SORBS2在心臟中大量表達(dá)，但其對(duì)單純性先天性心臟病的病因影響不大。我們猜測(cè)，SORBS2可能對(duì)心肌病變和細(xì)胞