蝰蛇（緬甸亞種）毒促凝—纖溶雙相活性組分FⅥbb的分離及生物活性研究.pdf

1、蝰蛇(緬甸亞種)屬于蝰亞科，是東南亞地區(qū)最常見的毒蛇種之一。蝰蛇毒主要表現(xiàn)為促凝活性，至今己從其中分離出多種促凝組分，如凝血因子X激活劑(RVV-X)、凝血因子V激活劑(RVV-V)等，而對其中纖維蛋白溶解組分的分離及性質研究報道較少。其纖溶組分的多少、纖溶生物活性特征未完全明了。本課題針對蝰蛇(緬甸亞種)粗毒初分后表現(xiàn)纖溶活性的組分進行了純化，卻發(fā)現(xiàn)分離終產(chǎn)物FⅥbb除可以直接溶解纖維蛋白原、纖維蛋白和酪蛋白外，還可以明顯縮短血漿凝固

2、時間，具有促凝活性。本實驗即闡述了組分FVIbb的分離過程和部分生物活性特點。 一、組分FVIbb的分離純化 蝰蛇(緬甸亞種)毒組分FVIbb經(jīng)過三步分離程序得到。粗毒經(jīng)CM-SephadexC-50陽離子交換層析得到12個蛋白峰，其中第2峰(FⅡ)和第6峰(FⅥ)具有較強的纖溶活性。FⅥ進一步經(jīng)Sephadex G-150(超細)凝膠過濾層析得到5個蛋白峰，其中第2峰即FVIb具有纖溶活性；將其再經(jīng)過Chelating

3、 Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析得到2個蛋白峰，其中第2峰(FVIbb)具有纖溶活性。最終回收率為4.24﹪。 FVIbb經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶，經(jīng)質譜測得分子量為59138，經(jīng)反相HPLC檢測組分FVIbb純度為94.98﹪。 二、FVIbb蛋白水解活力的測定 2．1 FVIbb的酪蛋白水解活性用水解Azo-Casein產(chǎn)生可溶于三氯乙酸的有色組分，使反應液的A390值

4、升高的方法觀察FVIbb的酪蛋白水解活性。Azo-Casein是蛋白水解酶的發(fā)色底物。 結果：FVIbb可水解Azo-Casein，且隨著FVIbb濃度的升高，反應液的A390值逐漸增大，顯示其蛋白水解活力逐漸增強。 2．2 FVIbb的纖維蛋白原溶解活性采用剩余可凝纖維蛋白原測定法，以FVIbb與纖維蛋白原共同溫育不同時間后，剩余的可凝纖維蛋白原含量減少的程度來表示其纖維蛋白原溶解活性。結果：溫育時間分別為1min、5

5、min、15min、30min和60min時，剩余可凝纖維蛋白原量(﹪)依次為74.4﹪、65.2﹪、47.8﹪、37.8﹪和18.1﹪。顯示隨著時間的延續(xù)，F(xiàn)VIbb水解掉的纖維蛋白原逐漸增多。 2．3 FVIbb的纖維蛋白溶解活性采用纖維蛋白平板法，將不同濃度的FVIbb 20ul點樣于纖維蛋白平板表面，以產(chǎn)生的透明溶解圈垂直兩直徑的乘積大小來表示纖溶活力。結果：FVlbb濃度分別為0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg

6、/ml、2mg/ml、2.5mg/ml和3mg/ml時，纖維蛋白溶解產(chǎn)生的透明溶解圈垂直兩直徑的乘積依次為18.46±1.93 mm<'2>、52.06±7.15mm<'2>、76.15±5.55mm<'2>、105.69±15.26 mm<'2>、124.82±4.9mm<'2>、151.81± 3.06 mm<'2>。顯示FVIbb能溶解纖維蛋白且在一定濃度范圍內(nèi)其纖溶活性具有量效關系。 2．4溫度、pH值、金屬離子和酶抑制

7、劑對FVIbb蛋白水解活性的影響在不同的溫度、pH值和金屬離子及抑制劑的環(huán)境中，F(xiàn)Ⅵbb水解Azo-Casein產(chǎn)生A390值的變化來考察環(huán)境對其活性的影響。結果顯示：FVIbb的最適溫度為40℃，最適pH為10.0；EDTA和DTT可顯著抑制其活性，PMSF和抑肽酶對其活性沒有影響；BE<'2+>、Ca<'2+>、Mg<'2+>可增強FⅥbb的蛋白水解活性，而Zn<'2+>、Ni<'2+>和Cu<'2+>可抑制其活性。表明FVIbb為

8、金屬蛋白酶，對熱不穩(wěn)定，在堿性條件下活性較好。 三、FVIbb降解纖維蛋白原及纖維蛋白活性的分析 3．1 FVlbb降解纖維蛋白原的作用 將0.5mg/ml的FVIbb加入纖維蛋白原溶液中溫育，在不同時間點取樣作SDS-PAGE。為考察。FVIbb降解纖維蛋白原的作用方式與人纖溶酶作用的異同，用同樣方法以0.5U/ml的人纖溶酶(Sigma)作對照。結果顯示：FVIbb對纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈均有水解作

9、用，但敏感性不同。Aα鏈1min后即消失，Bβ鏈30min后消失，γ鏈則需作用24h以上才緩慢消失。纖溶酶迅速降解纖維蛋白原，在15 min以內(nèi)纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈即完全降解。此外，F(xiàn)VIbb降解纖維蛋白原產(chǎn)生的水解片斷的大小與纖溶酶裂解纖維蛋白原產(chǎn)生的片斷大小不相同，說明二者的作用位點不同。 3．2 FVlbb降解纖維蛋白的作用 將FVlbb與間接溶纖的尿激酶(UK)共同作用于普通平板和加熱平板，在加熱平板

10、中，殘留在纖維蛋白原中的纖溶酶原因加熱而失活，對照兩平板可判斷FVIbb溶解纖維蛋白的作用方式。結果：在普通平板上FVIbb和UK均可產(chǎn)生透明溶解圈；而在加熱平板上FVIbb可產(chǎn)生同樣大小的透明溶解圈，UK則不能溶解纖維蛋白。表明FVIbb不是通過激活纖溶酶原而發(fā)揮作用的，其溶纖作用是直接酶解纖維蛋白。 用凝血酶將纖維蛋白原變成纖維蛋白，再加入2 mg/ml的FVIbb共育，在不同時間點中止反應，并取樣作SDS-PAGE。用同樣

11、方法以0.05U/ml的人纖溶酶(Sigma)0.15 ml作陽性對照。結果顯示：FVIbb可水解纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體，但作用較人纖溶酶慢，共育8小時后才出現(xiàn)α鏈和γ-γ二聚體的少量水解，24小時后降解完全。FVIbb降解人纖維蛋白產(chǎn)生的片斷與人纖溶酶產(chǎn)生的纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)不同。 四、FVIbb的促凝作用 以血漿復鈣時間(RT)的縮短來表示促凝活性。不同濃度的FVIbb與兔枸櫞酸鹽血漿混合，加入C

12、aCl<,2>后記錄抽出纖維蛋白細絲所需的時間即為血漿復鈣時間。用同樣方法比較FVIbb、蝰蛇粗毒和人凝血酶促凝活性的異同。結果：正常血漿復鈣時間為149.5±2.38s。FVIbb濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血漿復鈣時間依次為8.5±1s、11±1.15 s、7±2s、8.5±1s、8.5±1s。粗毒濃度分別為1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml和5mg/ml的血漿

13、復鈣時間依次為9±1.15s、9.5±1s、16.5±1.9ls、18±2.3s、22.5±1.9ls。表明FVIbb和粗毒均具有促凝活性，但其促凝活性的大小不呈劑量依賴性。 五、FVIbb的類凝血酶活性測定 采用反應板法測定FVIbb的類凝血酶活性。待測酶液與纖維蛋白原溶液混合，記錄抽出纖維蛋白細絲的時間。結果：2 mg/ml的FVIbb與纖維蛋白原混合不能形成纖維蛋白，且FVIbb與纖維蛋白原溶液混合10 min后再

14、加入凝血酶也無纖維蛋白形成。顯示FVIbb可溶解纖維蛋白原，沒有類凝血酶活性。 六、FVIbb的等電聚焦電泳 FVIbb的等電聚焦電泳結果顯示為兩個極接近的條帶，pI在4.8和4.9左右。表明FVIbb可能由兩種分子量相同、等電點不同但極接近的異構體組成；也可能FVIbb是糖蛋白，由于糖基化修飾的不同形成多個等電點；亦或FVIbb純化不夠徹底。 小結： 1、蝰蛇(緬甸亞種)粗毒依次經(jīng)過CM-Sephade

15、x C-50陽離子交換層析、SephadexG-150(超細)凝膠過濾層析和Chelating Sepharose Fast Flow金屬離子螯合親和層析分離得到電泳純的組分FVIbb，純度)94.5﹪，分子量為59138。 2、組分FVIbb即可水解纖維蛋白原和纖維蛋白，又可水解酪蛋白。對纖維蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈、γ鏈和纖維蛋白的α鏈、β鏈、γ-γ二聚體均有水解作用。 3、組分FVIbb可明顯縮短貧血小板血漿復鈣時間