牡蠣多糖組分的雙水相富集分離、結(jié)構(gòu)及生物活性研究.pdf

1、牡蠣(Concha Ostreae)中的多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒和降血糖活性。目前，牡蠣多糖的提取分離方法常用有熱水浸提法，柱層析法，但是存在步驟繁瑣、操作時(shí)間長(zhǎng)，效率低等問(wèn)題。低分子醇類與無(wú)機(jī)鹽構(gòu)成的雙水相體系具有成本低廉、溶液條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，能夠根據(jù)被萃取物的性質(zhì)進(jìn)行組成成分和比例的調(diào)整，達(dá)到最優(yōu)的萃取效率并確保其活性。本課題以來(lái)自閩南地區(qū)海域的太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)為原料，篩選出富集分離牡蠣

2、中性多糖和酸性多糖效果最佳的低分子醇/鹽雙水相體系，進(jìn)而分別對(duì)分離得到的兩種牡蠣多糖組分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析和生物活性研究。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　(1)對(duì)牡蠣粗多糖進(jìn)行超聲微波提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。得出響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果：超聲-微波輔助技術(shù)提取牡蠣多糖的最佳工藝條件為：提取時(shí)間26.26min，料液比1:102，溫度82℃。與傳統(tǒng)的水浴浸提法相比，超聲-微波提取法可以將傳統(tǒng)水提的3h縮短到26min，得率由24.55％增加到27.4

3、8%。進(jìn)一步對(duì)該優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證，獲得牡蠣粗多糖優(yōu)化得率Y=27.48?0.2%，以此作為牡蠣粗多糖提取的最佳提取條件參數(shù)。
　　(2)通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)條件處理，獲得的牡蠣粗多糖通過(guò)雙水相體系進(jìn)一步分離純化。首先，確定雙水相體系的相平衡數(shù)據(jù)，然后通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的雙水相體系相平衡數(shù)據(jù)擬合軟件(ATPS-LLE)運(yùn)行出雙水相體系雙節(jié)線和系線長(zhǎng)度（TLL）。
　　(3)其次，考察雙水相體系類型（乙醇/(NH4)2SO4體系，P

4、EG1000，PEG2000，PEG4000分別與(NH4)2SO4形成的雙水相體系），系線長(zhǎng)度（TLL=30，35，40，45，50）和不同濃度的牡蠣粗多糖對(duì)多糖分離純化的影響，采用苯酚-硫酸法測(cè)定兩相中的牡蠣多糖濃度，BCA法測(cè)定兩相中蛋白質(zhì)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：（27.29wt%）乙醇/(17.7wt%)硫酸銨雙水相體系能夠很好的富集分離小分子量的牡蠣中性多糖與大分子量的牡蠣酸性多糖，并且去除蛋白和雜質(zhì)，多糖粗提液在9mg/mL混合

5、分相后，下相多糖收率為53.21%，成品多糖中蛋白質(zhì)含量為0.32%，說(shuō)明雙水相富集的方法分離步驟少，條件溫和，可獲得高收率和高純度的小分子中性多糖，并且可以用于大量制備。
　　(4)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)上述乙醇/(NH4)2SO4體系與傳統(tǒng)方法（乙醇沉淀，DEAE-纖維素-52柱層析等）分離純化牡蠣粗多糖，分別得到天然的牡蠣中性多糖和酸性多糖用于牡蠣多糖生物活性研究。采用MTT比色法研究牡蠣多糖在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞Hepg-2的抑制增殖實(shí)驗(yàn)

6、，傳統(tǒng)方法分離的中性多糖（OGN1）的抑制率為52.94%，雙水相分離得到的牡蠣中性多糖(OGN2)抑制率為55.81%，說(shuō)明OGN2的抑制效果更好。通過(guò)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)到OGN2具有明顯的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Hepg-2凋亡和死亡的作用。在對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定中，OGN2增殖效果同樣最佳，增值率達(dá)到121.08%，對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和白介素-2(IL-2)的釋放量的比較能夠得知OGN2在25

7、0μg/mL時(shí)對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2的刺激指數(shù)達(dá)到124.81%，能夠有效的提高小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫活性。由于牡蠣多糖是一種動(dòng)物多糖，含有一定量的糖蛋白，說(shuō)明雙水相體系富集多糖時(shí)，條件溫和對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)損傷很小，從而相對(duì)傳統(tǒng)方法得到的多糖也表現(xiàn)出更好的生物活性。
　　(5)經(jīng)上述分離工藝的優(yōu)化組合，可獲得大量的小分子牡蠣中性多糖(OGN)組份，大分子酸性多糖(OGA)組份，對(duì)二者進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。HPLC-ELSD儀檢測(cè)牡蠣多糖單糖組成

8、，主要為葡萄糖，OGA和OGN的葡萄糖醛酸含量分別為1.33%，0.02%。IR光譜可判斷，OGN，OGA的主鏈都為α-D-吡喃型葡聚糖，不同點(diǎn)為OGA中2853cm-1為CH2伸縮振動(dòng)，1740cm-1，1440cm-1為糖分子中C=O（-COOH）的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明OGA中含有-COOH，并且含有葡萄糖醛酸。OGN、OGA組分的相對(duì)分子質(zhì)量和純度進(jìn)行分析，樣品峰型比較對(duì)稱，純度較高，計(jì)算得到OGN和OGA的分子量分別為3.48KD，9

9、80KD。甲基化分析推測(cè)OGN的主要結(jié)構(gòu)為：1,4-鏈接的主鏈上平均5.98個(gè)葡萄糖殘基有一個(gè)1,3,4-鏈接的支鏈，并且有少量1,2,4-鏈接的支鏈。OGA的主要結(jié)構(gòu)為：1,4-鏈接的主鏈上平均7.51個(gè)葡萄糖殘基有一個(gè)1,3,4-鏈接的支鏈。說(shuō)明多糖OGN和OGA連接方式基本相同，但是OGN支鏈更多。核磁共振譜分析，多糖連接位置C-1和C-4碳原子位置存在取代或者成鍵反應(yīng)，也證實(shí)了兩種組分都為α-D-吡喃型葡聚糖，本實(shí)驗(yàn)中NMR和甲

10、基化分析結(jié)果基本相符。OGN和OGA的結(jié)構(gòu)對(duì)比其生物活性分析，雖然兩種多糖單糖組成和連接方式相同，但是分子量相對(duì)較小、未帶電荷、支鏈相對(duì)多的中性多糖具有更好的生物活性。
　　(6)為進(jìn)一步提高牡蠣多糖組分的生物學(xué)活性，采用SO3-吡啶法對(duì)多糖OGN2和OGA1進(jìn)行了硫酸酯化修飾，獲得了2種硫酸酯化多糖SOGN和SOGA，測(cè)得其硫酸根含量分別為27.22%，16.85%，取代度分別為0.334和0.613。SOGN和SOGA的相對(duì)分

11、子量分別為3.38KD，23.4KD。體外小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SOGN增殖率可以到達(dá)139.17%，刺激指數(shù)也可以達(dá)到118.47%，OGN2增殖率為115.66%，刺激指數(shù)103.42%，與OGN2相比較，SOGN能夠明顯的促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖，免疫活性有所提高?？鼓[瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)方面，SOGN對(duì)人肝癌細(xì)胞Hepg-2抑制率能夠達(dá)到57.19%，OGN2的抑制率為52.96%，與OGN2相比較，SOGN的抑制率有所提高