HBV適應(yīng)性雜交細(xì)胞株的建立和初步研究.pdf

1、研究背景: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起嚴(yán)重肝臟疾病的病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球20多億人曾感染乙肝病毒，其中約3.5億人為慢性乙肝病毒感染者。慢性乙肝不易徹底治愈，并隨著病情發(fā)展可惡化成肝硬化、肝癌。自1965年Blumberg等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原，到1997年病毒全基因組的克隆和測(cè)序完成，人們對(duì)HBV的基因組成和抗原的結(jié)構(gòu)、生物特性及其生命周期的認(rèn)識(shí)迅速發(fā)展。但因缺乏體外增

2、殖系統(tǒng)和易獲得的細(xì)胞模型，HBV感染肝臟的早期機(jī)理研究進(jìn)展較為緩慢，從而在一定程度上影響乙型肝炎及其相關(guān)肝臟疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。由于人的肝組織來(lái)源有限，而且HBV病毒粘附以及DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制對(duì)宿主有嚴(yán)格的限制，先前研究過(guò)的細(xì)胞模型又各存在其不可避免的缺陷。因此，建立一個(gè)近于自然感染狀態(tài)即既適用于轉(zhuǎn)染又可用血清中病毒顆粒直接感染，接近肝細(xì)胞生理狀態(tài)并能穩(wěn)定表達(dá)HBV抗原的細(xì)胞模型是急需的。 本研究旨在通過(guò)將利用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生

3、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細(xì)胞與人原代肝細(xì)胞融合，建立雜交細(xì)胞株，這個(gè)雜交細(xì)胞株從細(xì)胞基因工程學(xué)理論上講應(yīng)該具有雙親遺傳學(xué)特性，即既具有人原代肝細(xì)胞對(duì)HBV易感的特性又具有HepG2細(xì)胞能體外長(zhǎng)期傳代的特性。并對(duì)HBV在該雜交細(xì)胞的感染情況進(jìn)行初步研究。 目的: 建立不同于HepG2細(xì)胞及人原代肝細(xì)胞的新型雜交細(xì)胞株，使該細(xì)胞株既能長(zhǎng)期攜帶HBV又能體外傳代培養(yǎng)。 方法:

4、 誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生HGPRT基因突變，將篩選出的HGPRT缺陷的HepG2細(xì)胞與攜帶HBV的人原代肝細(xì)胞進(jìn)行融合得雜交細(xì)胞，用HAT培養(yǎng)基篩選出異核體雜交細(xì)胞，再利用有限稀釋法進(jìn)行克隆，通過(guò)核型分析方法鑒定所得細(xì)胞。對(duì)所得雜交細(xì)胞及培養(yǎng)上清液進(jìn)行HBV DNA和HBsAg、HBeAg的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)，用未雜交的HepG2細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞作對(duì)照。 結(jié)果: 經(jīng)篩選后，有一雜交細(xì)胞株(HepCHLine3)克隆成功。

5、HepCHLine3在形態(tài)學(xué)上與HGPRT缺陷HepG2細(xì)胞相似，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示HepCHLine3雜交細(xì)胞染色體眾數(shù)為99條，證明為融合細(xì)胞株，含所有來(lái)自HepG2細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞的基因數(shù)。傳代培養(yǎng)的HepCHLine3及其培養(yǎng)上清液用巢式PCR可分別檢測(cè)到HBV DNA，培養(yǎng)上清液內(nèi)檢測(cè)到HBsAg和HBeAg。對(duì)照組的HepG2細(xì)胞和人原代肝細(xì)胞相應(yīng)結(jié)果為陰性。結(jié)果提示該細(xì)胞攜帶并分泌HBV DNA。