心肌祖細(xì)胞株的建立及篩選鑒定.pdf

1、第一部分啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建和功能鑒定。 目的：重組構(gòu)建攜帶有啟動(dòng)子基因α-MyHC和報(bào)告基因熒光素酶的質(zhì)粒。 方法：（1）PCR擴(kuò)增α-MyHC第四個(gè)外顯子上游5.5kb的片段，并將片段克隆入啟動(dòng)子質(zhì)粒載體pBGLuc，通過菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測(cè)定對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定，得到重組啟動(dòng)子質(zhì)粒MyHC-GLuc。（2）通過含2％HS的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑Dex檢測(cè)質(zhì)粒的有效性和特異性。 結(jié)果：（1

2、）啟動(dòng)子質(zhì)粒MyHC-GLuc可以有效地在肌細(xì)胞分化過程中激活；（2）進(jìn)一步研究證實(shí)，在肌肉細(xì)胞分化過程中僅有質(zhì)粒MyHC-GLuc被激活，而對(duì)照質(zhì)粒TOP-Luc未被激活；（3）Dex可以有效的誘導(dǎo)MyHC-GLuc的表達(dá)，且與形態(tài)變化相一致。 結(jié)論：?jiǎn)?dòng)子質(zhì)粒MyHC-GLuc具有肌肉特異性，且其活性在肌細(xì)胞分化過程中能夠被有效激活，因此，它可以方便快捷的應(yīng)用于肌肉細(xì)胞分化的研究中。 第二部分 RAR和RXR信號(hào)途徑

3、激活促進(jìn)肌細(xì)胞的分化。 目的：RAR和RXR信號(hào)途徑激活在C2C12成肌過程中的作用。 方法：（1）ATRA和9cisRA分別以最適劑量刺激C2C12，以Dex為對(duì)照，分別通過報(bào)告基因的測(cè)定，PCR，WB和IF來檢測(cè)肌肉細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化情況；通過組織學(xué)染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化；通過電鏡檢測(cè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)分化情況；（2）構(gòu)建和制備攜帶有人RA受體RARα和RXRα的腺病毒Ad-RARα和Ad-RXRα（3）通過Ad-R

4、ARα和Ad-RXRα直接感染C2C12，檢測(cè)細(xì)胞分化情況；（4）C2C12感染Ad-RARα和Ad-RXRα后，移植到裸鼠股四頭肌，兩周后處死動(dòng)物，取出標(biāo)本切片，研究過表達(dá)RARα和RXRα的C2C12在體內(nèi)分化情況。 結(jié)果：（1）1μMATRA和5μM9CRA相對(duì)于1μMDex，能夠更有效的促進(jìn)成肌過程，肌細(xì)胞晚期基因PAX3和TnT表達(dá)明顯較高，且細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，由原來的長(zhǎng)梭型逐漸演變?yōu)殚L(zhǎng)棒狀，細(xì)胞體積明顯增大，且細(xì)胞

5、之間有融合，電鏡下可見明顯的粗細(xì)肌絲結(jié)構(gòu)；（2）Ad-RARα和Ad-RXRα能夠有效感染C2C12，并可檢測(cè)出感染后C2C12表達(dá)RARα和RXRα量明顯增高；（3）Ad-RARα和Ad-RXRα感染C2C12后，C2C12表達(dá)肌細(xì)胞的早期標(biāo)志基因明顯降低，但是晚期基因明顯增高；（4）C2C12感染Ad-RARα和Ad-RXRα移植到體內(nèi)后，未形成明顯包塊，移植細(xì)胞沿肌梭走向分布，存活較好，但是排列沒有成熟肌組織規(guī)則，且分化程度不高。

6、 結(jié)論：RAR和RXR信號(hào)途徑可促進(jìn)C2C12成肌進(jìn)程。第三部分心肌祖細(xì)胞株的建立及篩選鑒定。 目的：建立穩(wěn)定來源于心臟的心肌祖細(xì)胞株，為研究影響心肌祖細(xì)胞在成體心肌細(xì)胞受損的情況下增殖分化的因素提供理想的細(xì)胞模型。 方法：（1）分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細(xì)胞；（2）通過感染逆轉(zhuǎn)錄病毒SSR69而使心肌細(xì)胞永生化，通過抗生素篩選和無限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細(xì)胞；（3）根據(jù)心肌細(xì)胞發(fā)育過程中基因表達(dá)變

7、化，篩選出具有心肌祖細(xì)胞特性的單克隆細(xì)胞株；（4）篩選出的5個(gè)心肌祖細(xì)胞單克隆，在Dex的誘導(dǎo)下，檢測(cè)報(bào)告基因和心肌細(xì)胞早晚期基因表達(dá)變化情況，衡量其分化能力。 結(jié)果：（1）成功分離培養(yǎng)出心肌細(xì)胞，部分細(xì)胞可見明顯搏動(dòng)；（2）感染病毒后，通過潮霉素篩成功選出76個(gè)單克隆，并將其進(jìn)行命名為CP15-＃；（3）對(duì)第1～20號(hào)克隆，根據(jù)心肌細(xì)胞發(fā)育過程中早中晚期的基因表情況篩選出5個(gè)具有心肌祖細(xì)胞特性的克隆CP15-5a，CP15-9