實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者PML-RARα融合基因轉(zhuǎn)錄本.pdf

1、目的:建立實(shí)時(shí)定量PCR(RQ—PCR)方法檢測(cè)初診急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因亞型(Long—form、Short—form和Variant—form)及其特異性異構(gòu)體(bcr1/2、P4R3、P46R3、bcr3和P2R3)，并探討融合基因亞型和特異性異構(gòu)體表達(dá)水平的臨床意義。 方法:根據(jù)“歐洲抗癌計(jì)劃”設(shè)計(jì)TaqMan探針和引物，建立RQ—PCR方法對(duì)長(zhǎng)型(Long—form)、短型(Shor

2、t—form)、變異型(Variant—form)三種類型PML/RARα陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)51例初診APL患者PML/RARα轉(zhuǎn)錄本含量，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳和測(cè)序；設(shè)計(jì)不同異構(gòu)體的特異性引物，建立異構(gòu)體特異性RQ—PCR方法對(duì)6種特異性異構(gòu)體PML/RARα陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)異構(gòu)體定量檢測(cè)的特異性，并檢測(cè)45例初診APL患者中不同異構(gòu)體的含量。 結(jié)果:51例APL初診患者中，33例為長(zhǎng)型PML/RARα陽(yáng)性患者，

3、3例為變異型PML/RARα陽(yáng)性患者，15例為短型PML/RARα陽(yáng)性患者?；颊咄庵苎准?xì)胞計(jì)數(shù)與年齡呈負(fù)相關(guān)(R=-0.376，P=0.014)，相關(guān)性主要見(jiàn)于長(zhǎng)型和變異型患者(R=-0.51，P=0.005)。短型患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于長(zhǎng)型患者(P=0.041)。而兩組患者在性別、年齡、外周血血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)，骨髓原始粒細(xì)胞及早幼粒細(xì)胞比例、獲得血液學(xué)完全緩解時(shí)間和分子生物學(xué)完全緩解時(shí)間等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 所

4、建立的檢測(cè)PML/RARα轉(zhuǎn)錄本各亞型的RQ—PCR方法最大敏感性均達(dá)10拷貝/μl，但其重復(fù)性較差，108～102拷貝/μl陽(yáng)性模板的重復(fù)性良好。正常對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。 36例長(zhǎng)型和變異型APL初診患者PML/RARα轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)含量為3.75×102～6.20×105拷貝/50ng(中位7.24×103拷貝/50ng)，相對(duì)含量為0.51％～676.87％(中位9.31％)。15例短型患者PML/RARα轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)含量

5、為2.26×103～2.33×106拷貝/50ng(中位1.17×105拷貝/50ng)，相對(duì)含量為12.04％～802.68％(中位95.26％)。短型患者體內(nèi)融合基因相對(duì)含量明最高于長(zhǎng)型患者(P＜0.01)。33例隨訪患者獲得血液學(xué)完全緩解時(shí)間與分子生物學(xué)完全緩解時(shí)間與患者的年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)及融合基因含量無(wú)相關(guān)性。 “歐洲抗癌計(jì)劃”推薦的短型RQ—PCR反應(yīng)體系能擴(kuò)增筑巢式PCR檢測(cè)為長(zhǎng)型、變異型和短型的PML/RARα

6、轉(zhuǎn)錄本，變異型反應(yīng)體系能擴(kuò)增筑巢式PCR檢測(cè)為長(zhǎng)型和變異型的PML/RARα轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)型反應(yīng)體系僅能擴(kuò)增筑巢式PCR檢測(cè)為長(zhǎng)型PML/RARα轉(zhuǎn)錄本；電泳及測(cè)序結(jié)果揭示短型RQ—PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增筑巢式PCR檢測(cè)為長(zhǎng)型PML/RARα的患者標(biāo)本可見(jiàn)3條條帶(621bp、477bp和218bp)，擴(kuò)增筑巢式PCR檢測(cè)為變異型PML/RARα的患者標(biāo)本也可見(jiàn)3條條帶(567bp、423bp和218bp)。長(zhǎng)型患者和變異型患者同時(shí)含有P4R3

7、和P46R3異構(gòu)體，短型患者同時(shí)含有P2R3異構(gòu)體。 鑒于上述結(jié)果，我們進(jìn)一步建立了檢測(cè)PML/RARα轉(zhuǎn)錄本6種特異性異構(gòu)體的RQ—PCR方法，最大敏感性均達(dá)10拷貝/μl，但其重復(fù)性較差，108～102拷貝/μl陽(yáng)性模板的重復(fù)性良好。正常對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。每個(gè)異構(gòu)體特異性RQ—PCR均不能將其它異構(gòu)體擴(kuò)增出。 45例APL初診患者中，長(zhǎng)型和變異型患者31例，其bcr1/2的絕對(duì)定量為1.73×102～7.65

8、×104拷貝/50ng(中位2.14×104拷貝/50ng)，相對(duì)定量為0.86％～208.01％(中位11.61％)；P4R3的絕對(duì)定量為7.3×102～1.38×105拷貝/50ng(中位1.46×104拷貝/50ng)，相對(duì)定量為0.71％～266.19％(中位18.13％)；P46R3的絕對(duì)定量為1.65×102～1.05×105拷貝/50ng(中位1.41×104拷貝/50ng)，相對(duì)定量為0.53％～222.90％(中位8.

9、65％)。14例短型患者bcr3的絕對(duì)定量為7.53×102～3.22×105拷貝/50ng(中位6.07×104拷貝/50ng)，相對(duì)定量為11.91％～326.55％(中位58.03％)；P2R3的絕對(duì)定量為48.87～1.39×104拷貝/50ng(中位8.72×102拷貝/50ng)，相對(duì)定量為0.02％～57.71％(中位0.93％)。短型患者bcr3的表達(dá)量明顯高于長(zhǎng)型、變異型患者bcr1/2的表達(dá)量(P=0.001)。長(zhǎng)型

10、患者中，bcr1/2、P4R3及P46R3三種異構(gòu)體表達(dá)量的高低無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.344)，bcr1/2及P4R3的表達(dá)量均與P46R3相關(guān)(R值分別為0.73和0.5，P值分別＜0.001和=0.04)，但兩者間表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性。14例短型患者均含有低水平P2R3表達(dá)，其表達(dá)量明顯低于bcr3(P＜0.001)，但兩者間并無(wú)相關(guān)性(P=0.714)?；颊攉@得血液學(xué)完全緩解時(shí)間和分子生物學(xué)完全緩解時(shí)間與融合基因特異性異構(gòu)體的表達(dá)量無(wú)