小膠質(zhì)細胞活化抑制對慢性EAE中軸索損傷的保護作用及米諾環(huán)素的影響.pdf

1、研究目的： 本研究利用慢性非緩解型小鼠實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（EAE）模型和小膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型，探討小膠質(zhì)細胞活化在慢性EAE軸索損傷中的作用機制，以及米諾環(huán)素的炎癥抑制和神經(jīng)保護作用， 研究方法： （一）動物實驗部分：利用MOG35-55抗原多肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE動物模型，分為對照組、EAE組和米諾環(huán)素治療組，分別在動物發(fā)病前期（～免疫后9天）、發(fā)病初期（免疫后12～17天）、發(fā)病高峰期（免

2、疫后21～25天）和慢性維持期（免疫后32天～）處死動物，取腦組織和脊髓。用組織學方法進行HE染色、LFB染色和Bielschowsky染色；免疫組化方法檢測Iba1、APP和NF蛋白；RT-PCR方法檢測IFN-γ和IL-10 mRNA含量；Western Blot方法檢測p-p38 MAPK蛋白含量。 （二）細胞實驗部分：建立小膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型，分為對照組、LPS活化組和米諾環(huán)素干預組，分別在3、6、12、24和48小時

3、取各組細胞培養(yǎng)液。利用ELISA方法檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量，Griess Reagent方法檢測NO含量。 研究結果： （一）動物實驗部分： 1、實驗小鼠的臨床神經(jīng)功能變化：對照組小鼠未發(fā)病；EAE組和治療組小鼠在免疫后12～17天相繼發(fā)病，臨床表現(xiàn)無差異，治療組開始用藥；21～25天到發(fā)病高峰期，EAE組較治療組小鼠臨床癥狀明顯加重；32天后進入維持期，兩組癥狀持續(xù)，治療組癥狀較輕，疾病呈典型的慢性

4、非緩解性特點。 2、實驗小鼠腦組織和脊髓的神經(jīng)病理變化：EAE組小鼠在發(fā)病高峰期HE染色見多個部位血管炎，血管周圍大量炎性細胞浸潤，成“袖套”樣改變，小血管明顯擴張；LFB染色見白質(zhì)疏松，髓鞘不連續(xù)、斷裂、空泡樣改變，部分區(qū)域髓鞘呈現(xiàn)白色片狀脫失；APP免疫組化染色可見到軸索急性損傷后的異常染色；Iba-1免疫組化染色見到激活的小膠質(zhì)細胞變大腫脹，出現(xiàn)突起，并數(shù)量增多；在EAE慢性維持期，Bielschowsky染色可見軸索腫脹

5、粗細不等、斷裂和變形，以及軸索卵形體的形成；NF免疫組化染色可見軸索結構變細、斷裂、變形、甚至缺失。治療組小鼠在相應發(fā)病期的病理上均有明顯減輕。 3、實驗小鼠在各時間點腦組織和脊髓內(nèi)炎性因子mRNA表達的變化：①IFN-γ mRNA表達的變化：對照組有少量IFN-γ mRNA的表達，在各時期表達也無變化。EAE組發(fā)病前期表達與對照組無差異，在發(fā)病初期表達顯著升高，并維持至發(fā)病高峰期，升高幅度達8～6倍，到慢性維持期以后，表達明顯

6、減弱，但仍高于對照組。治療組小鼠表達在發(fā)病初期與EAE組無差異，但在高峰期表達明顯減少，維持期的表達仍較EAE組減少，幾乎回到對照組水平。②IL-10 mRNA表達的變化：對照組有少量IL-10 mRNA的表達，在各時期表達也無變化。EAE組發(fā)病前期表達與對照組無差異，在發(fā)病初期表達開始升高，并維持至發(fā)病高峰期，到慢性維持期以后，表達繼續(xù)增高達6倍左右。治療組小鼠表達在發(fā)病初期與EAE組無差異，但在高峰期表達明顯增高，到慢性維持期表達仍

7、較EAE組明顯增高。 4、實驗小鼠在發(fā)病高峰期腦組織和脊髓內(nèi)p-p38 MAPK蛋白表達的變化：對照組有少量p-p38 MAPK蛋白的表達；EAE組的表達明顯升高，達3倍左右；治療組的表達顯著降低，但仍較對照組組為高。 （二）細胞實驗部分： 1、小膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)生長情況：培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞為圓形、折光性強的小細胞，經(jīng)FITC-IB4標記鑒定，純度達95％以上。用LPS激活活化后，形態(tài)上細胞胞體相對增大，呈巨噬細胞

8、樣，伴有多個細長的突起。 2、各時間點小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生細胞毒性因子表達的變化：對照組正常細胞生長環(huán)境中也有少量存在，其產(chǎn)生也具有時間依賴性?；罨M細胞經(jīng)LPS激活后產(chǎn)生的TNF-α水平升高最早，在3小時已有顯著增高；IL-1β在6小時才出現(xiàn)顯著性升高；而NO最晚，直到12小時才出現(xiàn)顯著性升高。干預組中的TNF-α在3～48小時各時間點均可見到其含量較活化組顯著下降；IL-1β在6～48小時時間點可見含量到較活化組顯著下降；而NO在