基于毛細(xì)管電泳的量子點生物探針分離檢測新技術(shù)研究.pdf

1、隨著生命科學(xué)的發(fā)展，待測生物樣品的復(fù)雜性越來越高，從而對分析方法的檢測靈敏度、效率、速度、通量及成本提出了更高要求。作為一種新型的熒光探針，量子點具有有機(jī)熒光染料和熒光蛋白無法比擬的光學(xué)性質(zhì)，近年來基于量子點的熒光分析法已在生物分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。另一方面，作為一種高分辨、高靈敏、高速度、高通量及低樣品消耗的微分離技術(shù)，毛細(xì)管電泳在生物分析領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景?；诖?，本論文將上述兩種分析方法進(jìn)行了結(jié)合，建立了一種基于量子點探針

2、和毛細(xì)管電泳的分析新方法（即利用量子點作為熒光探針，毛細(xì)管電泳熒光檢測作為分析手段，），并重點研究了其在生物分析檢測中應(yīng)用。論文完成的工作如下：
　　 （1）采用毛細(xì)管篩分電泳對不同粒徑的水溶性CdSe/ZnS 核殼量子點進(jìn)行了分離，并探討了篩分介質(zhì)的種類和濃度、緩沖溶液的濃度和pH、分離電壓對量子點分離的影響。在這些因素優(yōu)化條件下，四種不同粒徑的量子點得到了有效分離，且重現(xiàn)性良好，遷移時間的最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01％，且量子

3、點的電泳淌度和粒徑間存在著很好的相關(guān)性（R 2=0.997）。實驗證實，這一方法可用于水溶性CdSe/ZnS 核殼量子點的粒徑測量。這一工作為量子點粒徑的檢測提供了一種新的方法，同時也為接下來基于毛細(xì)管電泳技術(shù)和量子點熒光探針的生物分析提供了重要參考。
　　 （2）分別選用發(fā)射波長為532 nm的CdTe 量子點和632 nm的CdSe/ZnS 量子點作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的供體和受體，通過共價偶聯(lián)的方法將上述兩種量子點分別標(biāo)

4、記上小鼠lgG和羊抗小鼠lgG，抗原和抗體間的免疫親和作用拉近了兩種量子點間的距離，從而導(dǎo)致供體和受體間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生。我們利用毛細(xì)管電泳對上述熒光共振能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行了分析。實驗中，為了同時檢測兩種量子點的熒光強(qiáng)度變化，我們利用兩個固定檢測波長通道分別對供體和受體的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了同時檢測。在成功地通過毛細(xì)管電泳實現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系與其它“多余”的熒光物得到有效分離的同時，準(zhǔn)確測量了供體及受體的熒光強(qiáng)度，并計算了不同濃度受體情況

5、下的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（38.56-69.58％），這一效率比常規(guī)的熒光強(qiáng)度測量法得到的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率（12.77-52.37％）有一定程度的提高，而且對熒光共振能量轉(zhuǎn)移的觀察更加直觀，靈敏度更高，樣品消耗更少。這一工作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的研究提供了一種新的分析方法。
　　 （3）分別利用親和素-生物素系統(tǒng)及直接共價偶聯(lián)的方法將熒光發(fā)射波長為585和650 nm的CdTe 量子點與兩種具有不同堿基序列的分子信標(biāo)進(jìn)行了連接

6、，構(gòu)建得到了兩種量子點-分子信標(biāo)探針。量子點-分子信標(biāo)探針與不同靶標(biāo)雜交后的毛細(xì)管電泳結(jié)果表明，這兩種量子點-分子信標(biāo)探針都只與和其環(huán)狀部分序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)特異性雜交，且都具有對單堿基突變識別的能力。利用這兩種量子點-分子信標(biāo)探針，我們借助毛細(xì)管電泳成功地實現(xiàn)了對特定核酸序列兩個位點單堿基突變的同時檢測。這一研究不僅為今后多位點的核酸單堿基突變檢測提供了重要手段，而且在諸如核酸高靈敏度檢測及單核苷酸多態(tài)性研究領(lǐng)域中也有很廣泛的應(yīng)用前景

7、。
　　 （4）分別將CdSe/ZnS 量子點及金納米顆粒與不同堿基長度的互補(bǔ)DNA單鏈進(jìn)行了偶聯(lián)，并通過DNA鏈的互補(bǔ)雜交將量子點與金納米顆粒連接到一起，構(gòu)建得到了一個研究溶液中金屬增強(qiáng)量子點熒光的模型，然后利用毛細(xì)管電泳考察了金納米顆粒和量子點間的距離對量子點熒光增強(qiáng)的影響。實驗結(jié)果表明溶液中的金納米顆粒增強(qiáng)量子點熒光有很強(qiáng)的距離依賴性，只有與金納米顆粒與量子點相距6.8-18.7nm 時，量子點才出現(xiàn)熒光增強(qiáng)效應(yīng)，其中11