Tbx18+前體心外膜祖細胞分化為竇房結起搏細胞的實驗研究.pdf

1、第一部分 Tbx18譜系示蹤模型和敲除模型的建立
　　目的:如何示蹤Tbx18+前體心外膜心臟祖細胞(proepicardialcardiac progenitor cells，CPCs)在胚胎發(fā)育過程中的的分化具有一定的難度，因此我們建立了兩種示蹤模型系統(tǒng)Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz，用來示蹤Tbx18+CPCs在胚胎發(fā)育中的表達模式。為觀察轉錄因子Tbx18基因缺失后竇房結在胚胎的發(fā)育過程中是否受到影響，

2、我們采用Tbx18:Cre/Cre基因敲除模型來動態(tài)觀察在竇房結在發(fā)育的過程中形態(tài)結構的變化。實驗通過基因表達和蛋白表達兩個方面分別檢測Tbx18示蹤模型和基因敲除模型是否建立成功。
　　方法:采用性成熟雌性基因型為Tbx18:Cre/-小鼠與雄性兩種純合子報告基因型為Rosa26EYFP/Lacz交配得到子代鼠，通過定性PCR法和X-gal染色法篩選出雙雜合譜系示蹤模型，基因型為Tbx18Cre/Rosa26EYFP/Lacz的

3、小鼠。性成熟基因型均為Tbx18: Cre/-的雌鼠與雄鼠交配得到子代敲除鼠，通過RT-PCR檢測基因拷貝數(shù)鑒定出Tbx18基因敲除小鼠和野生型小鼠。
　　結果:通過PCR法鑒定，共同表達Cre和報告基因Rosa26EYFP為雙雜合示蹤小鼠，在X-gal染色法中，腳趾被染成藍色的對應標本為Tbx18Cre/Rosa26Lacz雙雜合模型。且示蹤模型和基因敲除模型小鼠基本上符合孟德爾遺傳定律，無遺傳遺漏現(xiàn)象和報告基因的突變情況。兩種

4、譜系示蹤模型可有效示蹤Tbx18+CPCs及衍生的細胞表達模式。在基因敲除模型中，觀察出Tbx18敲除鼠在胚胎后期或者出生后24小時內有致死性，與cre基因拷貝數(shù)鑒定結果一致。
　　結論:兩種譜系示蹤模型Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz和基因敲除模型Tbx18:Cre/Cre建立成功。其中示蹤模型可示蹤通過檢測Cre重組酶的表達特異性的示蹤Tbx18+CPCs及衍生細胞的表達，即反應了Tbx18+CPCs的分化及

5、衍生細胞的分化命運，敲除模型可觀察小鼠胚胎發(fā)育過程中Tbx18缺失后竇房結的發(fā)育情況。
　　第二部分小鼠Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結起搏細胞
　　目的:小鼠Tbx18+CPCs具有多分化的潛能，研究心臟祖細胞的起源和分化從病醫(yī)學的角度闡明先天性和獲得性心臟疾病的發(fā)病機制。竇房結起搏電流If由超極化激活環(huán)核苷酸-門控陽離子通道(HCN)編碼，其中HCN4+竇房結起搏細胞占主要貢獻。心臟祖細胞分化為竇房結起搏細胞的

6、研究機制尚未清楚，實驗研究小鼠Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結起搏細胞及轉錄因子Tbx18在小鼠竇房結發(fā)育形成中起到的作用。
　　方法:建立了兩種示蹤模型Tbx18:Cre/Rosa26EYFP/Lacz和基因敲除小鼠Tbx18: Cre/Cre模型，該示蹤模型通過cre重組酶的表達能有效的示蹤Tbx18+CPCs分化為HCN4+竇房結心臟起搏細胞的命運。通過HE染色、免疫熒光技術及X-gal整體和切片的染色來追蹤Tbx

7、18+CPCs分化為HCN4+竇房結起搏細胞和基因敲除組竇房結形態(tài)的改變。在功能學上通過對新生野生型或雜合子與基因敲除小鼠心電圖分析，觀察兩組新生小鼠心率的變化。
　　結果:基因譜系示蹤模型揭示Tbx18+CPCs可分化為HCN4+竇房結心臟起搏細胞，主要分化為竇房結頭部的HCN4+起搏細胞，分化為竇房結尾HCN4+起搏細胞較少?；蚯贸Ｐ完U明Tbx18缺失后，新生小鼠竇房結頭部HCN4+心臟起搏細胞減少，頭部形態(tài)缺失，竇房結尾