NK-92細(xì)胞對人卵巢癌治療活性的研究.pdf

1、目的:1.探討不同劑量放射線照射后NK-92細(xì)胞治療人卵巢癌的安全性.2.探討合適劑量放射線照射后NK-92細(xì)胞治療人卵巢癌的有效性.方法:1.體外實驗部分1.1細(xì)胞計數(shù)法檢測照射后NK-92細(xì)胞的增殖情況0、100、200、400、800、1600 cGy放射線照射后NK-92細(xì)胞培養(yǎng)于六孔板,每組3復(fù)孔,每孔細(xì)胞濃度5×10<'4>/ml,每日細(xì)胞計數(shù),連續(xù)監(jiān)測5天.1.2 <'3>H-TdR摻入法檢測照射后48hr NK-92細(xì)胞

2、的增殖活性 0、100、200、400、800、1600 cGy放射線照射后,調(diào)整NK-92細(xì)胞濃度,于96孔平底板上每孔加入細(xì)胞4×10<'4>/200μ1,37℃ 5％CO<,2>孵箱中培養(yǎng),結(jié)束培養(yǎng)前更換培養(yǎng)基為RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)2h;每孔加入<'3>H-TdR 0.5μCi,37℃ 5%CO<,2>溫箱培養(yǎng)4h,用多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上,抽氣過濾并用蒸餾水充分洗滌;將濾紙烤干后放入閃爍杯中,加入閃爍液,

3、β-液閃儀檢測cpm值.1.3 臺盼藍(lán)拒染法檢測照射后24、48、72 hrNK-92細(xì)胞的活力取0.2%臺盼藍(lán)鹽溶液與待計數(shù)的細(xì)胞懸液1:1混合(細(xì)胞在染料中停留時間為3-10min),取10μl含臺盼藍(lán)的細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)室中,至少計數(shù)總數(shù)500個細(xì)胞,分別計數(shù)未染色的活細(xì)胞數(shù)和染為藍(lán)色的死細(xì)胞數(shù).按下面的公式計算活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力.細(xì)胞數(shù)/mi=4大格活細(xì)胞總數(shù)/4×10<'4>×稀釋倍數(shù) 細(xì)胞活力(%)=活細(xì)胞數(shù)/

4、(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100% 1.4 FACS檢測照射后NK-92細(xì)胞凋亡變化 收集照射后(0、200、400、800 cGy)NK-92細(xì)胞,用冷PBS洗2次,1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整濃度為1×10<'6>/ml;取100μl(1×10<'5>細(xì)胞),加入5μl Annexin V-FITC,輕輕混勻,常溫避光放置15min;1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞2次,加入10μl PI,輕輕混勻,常溫避光

5、放置10min;1×Binding Buffer 400μl重懸細(xì)胞,上機檢測.1.5 <'51>Cr釋放法檢測NK-92細(xì)胞對HO-8910和K562細(xì)胞的體外殺傷活性 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的4hr<'51>Cr釋放法,檢測未照射及照射后NK-92細(xì)胞對HO-8910和K562細(xì)胞的體外殺傷活性,每次試驗要求自然釋放組cpm值<25%最大釋放組cpm值,按下列公式計算殺傷活性:細(xì)胞殺傷活性(%)=實驗組cpm值-自然釋放組cpm值/最大釋放組cp

6、m值-自然釋放組cpm值×100% 1.6 FACS檢測照射前后NK-92細(xì)胞主要表面標(biāo)志CD56表達(dá)情況 收集照射后(0、800 cGy)NK-92細(xì)胞,用PBS洗2次,100μl PBS重懸細(xì)胞;加入適量Fc受體阻斷劑,4℃避光放置30min;加入適量的特異性表面標(biāo)記熒光抗體,4℃避光放置30min;PBA洗兩遍,用400μl PBA重懸細(xì)胞,上機檢測.2.體內(nèi)實驗部分 2.1 照射后NK-92細(xì)胞在NOD/SCID鼠體內(nèi)的成瘤性

7、將1×10<'7>個照射后(800 cGy)NK-92細(xì)胞腹腔注射于NOD/SCID鼠,觀察小鼠有無腫瘤形成及重要臟器病理組織學(xué)檢測有無腫瘤細(xì)胞浸潤.2.2建立卵巢癌NOD/SCID鼠腫瘤模型將處于對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞株HO-8910經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,離心收集,計數(shù)后重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,配制成每0.1ml含1×10<'6>個HO-8910細(xì)胞的懸液;用1ml注射器將上述0.1ml細(xì)胞懸液皮下注射于NOD/S

8、CID鼠左側(cè)腋下.2.3放射線照射后NK-92細(xì)胞對荷瘤鼠的治療效果腫瘤對照組僅輸注HO-8910細(xì)胞,每只1×10<'6>個細(xì)胞;腫瘤治療組輸注HO-8910細(xì)胞,每只1×10<'6>個細(xì)胞,同時輸注照射后(800 cGy)NK-92細(xì)胞,每只1×10<'7>個細(xì)胞,以后每5天輸注經(jīng)過上述處理的NK-92細(xì)胞,共3次.觀察腫瘤體積、小鼠生存期.結(jié)論:1.大于400 cGy劑量的放射線照射可以抑制體外培養(yǎng)NK-92細(xì)胞的增殖能力.2.在

9、一定放射線劑量范圍(400-800 cGy)內(nèi),NK-92細(xì)胞的殺傷活性無明顯降低.3.800 cGy劑量放射線照射可以抑制NK-92細(xì)胞的增殖能力,同時最大限度地保留其殺傷活性.4.400、800 cGy劑量放射線照射后,NK-92細(xì)胞凋亡比例明顯增加.5.800 cGy劑量放射線照射后,NK-92細(xì)胞表面主要標(biāo)志無變化.6.800 cGy劑量放射線照射后的NK-92細(xì)胞輸注NOD/SCID鼠體內(nèi)是安全的.7.800 cGy劑量放射線