抗AIBI單克隆抗體1A-,2-E-,1-和4B-,9-F-,12-的制備、鑒定及雙抗體夾心ELISA試劑盒的構(gòu)建.pdf

1、[目的] 利用合成抗原GST-AIB1-N和GST-AIB1-C分別免疫BALB/c小鼠，采用傳統(tǒng)的單抗制備技術(shù)，制備分別針對AIB1蛋白氮端和碳端的單克隆抗體，生物素標(biāo)記其中的一株抗體，構(gòu)建雙抗體夾心ELISA方法，探討其在AIB1蛋白檢測中的應(yīng)用價值。 [方法與結(jié)果]1．利用合成抗原GST-AIB1-N和GST-AIB1-C分別免疫：BALB/c小鼠，采用傳統(tǒng)的雜交瘤制備技術(shù)，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗AIB1-N單克隆抗

2、體的雜交瘤細(xì)胞株和1株能穩(wěn)定分泌抗AIB1-C單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用體內(nèi)擴(kuò)增法獲得了含大量特異性抗體的腹水，通過系列濃度梯度飽和硫酸胺初步純化，透析除鹽，再使用 Protein GSepharose<'TM> 4 Fast Flow親和層析柱進(jìn)一步純化，得到高純度優(yōu)質(zhì)抗體。通過Westem-blot法鑒定抗體的特異性，免疫雙擴(kuò)鑒定其亞類，間接ELISA法測定其效價。經(jīng)鑒定亞類均為IgG1型，1A2E1效價為1：409600；48

3、9F12效價為1：102400，Westem-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)1A2E1和489F12分別可以特異性識別靶細(xì)胞T47D中AIB1蛋白，與載體蛋白及BSA無交叉反應(yīng)。 2.用生物素N-羥基丁二酰胺酯(BNHS)對純化抗體1A2E1進(jìn)行標(biāo)記，獲得了Biotin-1A2E1，標(biāo)記抗體效價為1：3200。應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)，對靶細(xì)胞中AIB1的檢測進(jìn)行了初步探討。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞呈陽性表達(dá)，免疫熒光結(jié)果實驗組腫瘤細(xì)胞顯

4、示熒光表達(dá)強(qiáng)，而對照組均為陰性。 3.抗AIB1雙單克隆抗體夾心EIASA方案的構(gòu)建：應(yīng)用抗AIB1-C單克隆抗體489F12作為固相抗體，Biotin-1A<,2>E<,1>作為標(biāo)記抗體，ELISA雙抗體夾心法檢測AIB1。試劑盒構(gòu)建及優(yōu)化的內(nèi)容包括：最適包被濃度、最適包被緩沖液的選擇、生物素標(biāo)記抗體工作濃度的選擇；試劑盒鑒定的指標(biāo)包括敏感性、特異性、穩(wěn)定性等。實驗數(shù)據(jù)顯示，使用0.05MpH9.6CB(碳酸鹽緩沖液)為包被緩沖液，包