復(fù)層電紡膜用于硬腦膜替代材料的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　由外傷、炎癥、腫瘤侵蝕粘連、手術(shù)切除或先天畸形等情況引起硬腦(脊)膜缺損在臨床上很常見,這種缺損或愈合不良可以引起很多并發(fā)癥,如腦脊液滲漏、顱內(nèi)感染、腦膜炎和癲癇等,是神經(jīng)外科手術(shù)中經(jīng)常需要解決的一個(gè)問題。
　　傳統(tǒng)的硬腦膜替代材料中,自體組織、同種異體組織、異種組織存在取材不便或潛在病毒感染風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn),近年來已較少應(yīng)用,曾經(jīng)使用的人工惰性材料不能體內(nèi)降解,長期存留易產(chǎn)生慢性炎癥和排異反應(yīng)。目前臨床廣泛

2、應(yīng)用的硬腦膜替代材料是異體異種組織中單獨(dú)提取的活性膠原蛋白,經(jīng)重組和無害化處理制成薄膜材料稱為膠原基質(zhì),它不會造成炎癥反應(yīng)或異物反應(yīng),可以促進(jìn)創(chuàng)面組織修復(fù)和硬腦膜新生并可以自然降解,在臨床應(yīng)用中總體的效果比較滿意。但是膠原基質(zhì)自身力學(xué)強(qiáng)度差,為腦組織提供的保護(hù)有限,硬腦膜下腔封閉不佳等缺點(diǎn)使術(shù)后增加了腦脊液漏的風(fēng)險(xiǎn),限制了其廣泛的應(yīng)用。近年來人工合成可降解聚合物具備了優(yōu)良的力學(xué)性能和體內(nèi)可降解特性,成為組織工程材料研究的熱門,但其不足是

3、自身缺乏生物活性對創(chuàng)面愈合及自身硬腦膜的新生沒有明顯的促進(jìn)作用。
　　靜電紡絲能夠簡單快速的生成納米纖維,已成為有效制備納米纖維材料的主要途徑之一。電紡材料具有良好的超微構(gòu)造,能構(gòu)建類細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu),其相互連通的孔隙有利于細(xì)胞長入,有高度的表面體積比,擴(kuò)大了與細(xì)胞的接觸面積,因此靜電紡絲技術(shù)廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。
　　本研究的目的是模仿天然硬腦膜的構(gòu)造,使用靜電紡絲技術(shù)制作復(fù)層結(jié)構(gòu)硬腦膜替代材料,結(jié)合活性膠原與人

4、工合成可降解材料各自的優(yōu)點(diǎn),在整體保留良好力學(xué)性能同時(shí),通過分層結(jié)構(gòu)讓材料的內(nèi)表面減少與腦組織的粘連,中間層起到加固和防水作用,外層含有膠原成分發(fā)揮生物活性并促進(jìn)組織再生。提出復(fù)層電紡膜作為硬腦膜替代材料的研究意義和應(yīng)用前景。
　　研究方法：
　　1.電紡膜的制備:靜電紡絲制作不同配比的膠原、PCL和PLA電紡膜材料,根據(jù)力學(xué)性能,柔軟度和電紡穩(wěn)定性確定各層電紡膜成分構(gòu)成,優(yōu)化電紡參數(shù)并制作完整的復(fù)層電紡膜修補(bǔ)材料。

5、　　2.電紡膜的表征及特性:掃描電子顯微鏡下觀察電紡膜的微觀形態(tài),測量纖維直徑及孔徑。測量力學(xué)性能、吸水率、孔隙率、防水性、體外降解率等,并與膠原基質(zhì)進(jìn)行對比測試。
　　3.電紡膜的細(xì)胞相容性及內(nèi)外層結(jié)構(gòu)對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞功能的影響:分別在內(nèi)外層材料上培養(yǎng)HSF細(xì)胞,觀察電紡膜表面的細(xì)胞生長情況,吖啶橙染色MTT檢測材料的細(xì)胞相容性;粘附實(shí)驗(yàn)、定量PCR和Westernblot等方法,對比內(nèi)外層上生長的成纖維細(xì)胞粘附性和分泌細(xì)胞

6、外基質(zhì)等主要功能,了解內(nèi)外層材料對細(xì)胞活性的影響。
　　4.電紡膜動物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn):SD大鼠皮下植入電紡膜以驗(yàn)證生物相容性,HE染色,掃描電鏡觀察電紡膜表面和內(nèi)部的細(xì)胞生長情況。構(gòu)建新西蘭兔硬腦膜缺損動物模型,電紡膜作為硬腦膜替代材料植入實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證材料的動物體內(nèi)植入效果,HE染色觀察電紡膜內(nèi)部細(xì)胞生長情況,植入部位腦組織HE染色觀察材料植入的實(shí)際效果和影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.通過電紡參數(shù)優(yōu)化和電紡膜力學(xué)性能測試

7、確定了復(fù)層電紡膜的構(gòu)成。PLA為內(nèi)層材料;PLA/PCL(1/1)電紡膜在實(shí)驗(yàn)分組中擁有最大的抗拉強(qiáng)度,并且斷裂伸長與柔軟度較好,用于中層材料制作;6％wt膠原/PLA(4/1)電紡溶液組在保證膠原含量最大化的前提下能夠得到穩(wěn)定良好的電紡纖維,用于外層材料的制作。通過連續(xù)的分層電紡技術(shù)制作復(fù)層電紡膜,通過電紡時(shí)間控制材料的厚度,內(nèi)層電紡時(shí)間2h、中層4h、外層6h,靜電紡絲完成后整個(gè)電紡膜厚度約為150~300μm。
　　2.電紡

8、膜與膠原基質(zhì)在力學(xué)性能、孔隙率、吸水率、防水性上進(jìn)行對比測試,電紡膜各項(xiàng)性能有顯著提高。
　　3.HSF細(xì)胞能夠在電紡膜內(nèi)外層材料上生長并正常增值,吖啶橙染色與MTT檢測顯示在材料外層上生長的細(xì)胞增值性優(yōu)于內(nèi)層和培養(yǎng)板對照;粘附實(shí)驗(yàn)顯示外層材料有利于HSF細(xì)胞粘附;定量PCR和Westernblot的結(jié)果顯示在外層材料上生長的HSF細(xì)胞在分泌細(xì)胞外基質(zhì)功能上優(yōu)于內(nèi)層和培養(yǎng)板對照。
　　4.大鼠皮下植入電紡膜后組織細(xì)胞能夠在材

9、料內(nèi)外層上貼附并生長,HE染色顯示外層材料較內(nèi)層材料中有更多成纖維細(xì)胞和表皮樣細(xì)胞遷移生長入內(nèi)部。構(gòu)建新西蘭兔硬腦膜缺損動物模型,植入復(fù)層電紡膜替代材料術(shù)后動物恢復(fù)良好,未出現(xiàn)切口感染和顱內(nèi)感染征象。電紡膜材料取出時(shí)內(nèi)表面與腦組織無明顯粘連,材料外層則與周圍組織緊密貼合,剝離時(shí)有一定阻力;移植部位及周邊的腦組織表面顏色正常、無明顯損傷、水腫、炎性反應(yīng)。電紡膜HE染色可見材料外層較內(nèi)層有更多成纖維和表皮樣細(xì)胞長入其中;植入部位腦組織HE染

10、色顯示電紡膜與自身筋膜對照組沒有明顯差異,均未出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)及肉芽組織增生的痕跡。
　　結(jié)論：
　　本課題運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)制作了具有良好超微結(jié)構(gòu)的復(fù)層硬腦膜替代材料,其結(jié)構(gòu)模仿了天然硬腦膜,成分為內(nèi)層PLA、中層50%PLA50%PCL、外層80%膠原20%PLA,三層的厚度比例約為1:2:3,總體厚度約為150~300μm。電紡膜與臨床常用的膠原基質(zhì)材料對比在力學(xué)性能、吸水率、孔隙率、防水性上有明顯提高。通過在電紡膜上培